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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
请问普通PCR和RT-qPCR大家都做吗?还是只做一种,如果两个实验结果对不上怎么办?
天一湖医者
实时定量PCR和半定量PCR结果不相同很正常,毕竟半定量PCR的误差很大,在做半定量的时候,你一定要把内参基因调的,在各个组织中表达量是一样的,这样才能做目的基因。而实时定量PCR就不存在这样的问题,所以我觉得还是你的半定量可能调的cDNA没有调好。
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问
提取质粒,但是再次用通用引物电泳验证时,在最上方跑出一条条带,请问是为什么呢?
天一湖医者
做酶切了么?如果抽出来没有酶切因为质粒的不同构型,会看到不同的条带。如果抽完质粒再做一个单酶切,得到的就是线性的条带,就只有一条了。
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问
qPCR引物连续四个G或者自我互补分数太高可以用吗?
天一湖医者
可以用,但也不要太高,否则不利Taq 酶的催化反应。
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问
构建载体一直构建不上,可咋整?
天一湖医者
1.确保克隆到的基因完全正确:如果这一步出问题,无非两点原因:引物设计不合理,模板质量不高。解决方法:多找几个模板同时进行克隆;重新评估引物的合理性和特异性,比如将引物长度增至40 bp左右。2.关于酶切酶切其实要求并不十分严格,正常操作下,不论电泳检测是否十分清楚,酶切产物足够连接用量了,没必要纠结。
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问
DNA抽提后浓度稀释问题
天一湖医者
浓度20ng/ul以上足够了,如果用的是组织提取,浓度一般很高,可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞,浓度低一些也没有关系。
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问
RNA抽提方法的比较
汤姆卜丽波
Trizol就是准备和提取上比较复杂,但其实提好了效果会比试剂盒好一点
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问
WB实验添加蛋白的量多少?
天一湖医者
Western blot实验中,蛋白上样没有特别固定的含量标准的。如果按照单一条带印染效果好来说的话,蛋白上样一般含量2~5微克就可以了。如果是表达提取总蛋白的话,为了让目的条带能够被检测到,总蛋白量可以提高一些,10~20微克都可以的。
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问
菌液PCR全假阳性,咋回事
cab2
可以先用cracking液裂解细菌,然后菌液跑胶看质粒大小
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问
荧光定量pcr遇到的问题,求助
Bumihiko
一般来说影响不大的,既然说明书写30s已经足够的话,就没必要用60s那么长时间,不过用了60s结果应该也会差不多
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问
载体构建时遇到了问题
汤姆卜丽波
这应该是酶切位点不太对,没有在产物头尾,在产物中间
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问
co-ip igg组出现和目标条带相同位置 相同强度的条带,怀疑是igg或者磁珠结合了目的蛋白,更换igg可以吗?
汤姆卜丽波
可以啊,本来就应该是和ip同源的
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问
细胞培养中如果染菌了,会对CCK-8的测量结果产生什么影响
汤姆卜丽波
如果细胞被污染了那整体吸光度肯定会变
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问
铁死亡中用亚铁你们用的是什么呢?以及怎么配置的吖?
bamboopiggy
可以用硫酸亚铁铵来处理细胞,参考:Nano-targeted induction of dual ferroptotic mechanisms eradicates high-risk neuroblastoma 最大用到了600uM
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问
卵巢组织如何提取巨噬细胞?
bamboopiggy
将组织研磨成单细胞悬液,然后用CD68标记巨噬细胞M,φCD163标记M2,进行流式分选
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问
小鼠小胶质细胞BV2从公司买回来复苏以后,细胞长了伪足,用的Gibco的血清和BBI的DMEM培养基养的,它还能长成圆形吗?
汤姆卜丽波
伪足也有可能是正常的吞噬连接其他细胞的状态。再养两天看看
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问
病毒传代细胞培养中,每次传代都需要PCR检测病毒浓度吗?还是说每隔几代检测一下就可以
Miracle星
为了数据更加严谨,建议每一代都检测一下病毒浓度,自己也可以记录对比!更有说服力
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问
如果想检测淋巴结或者脾脏的细胞因子,有什么合适的方法吗?
balalaLy
组织消化成单细胞流式检测蛋白表达切片免疫组织化学染色检测蛋白表达组织裂解提蛋白wb、elisa测蛋白提rna pcr检测
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问
求助:关于医学免疫学抗原的知识
Miracle星
根据抗原刺激机体产生抗体时是否需要Th细胞辅助而将抗原分成两类:胸腺依赖性抗原(thymus dependant antigen,TD-Ag)和胸腺非依赖性抗原(thymus independent antigen,TI-Ag)。TD-Ag是指在刺激机体B细胞产生抗体时需Th细胞辅助的抗原。B细胞通过BCR识别抗原的B细胞表位,内吞并将抗原降解成短肽,通过与MHC Ⅱ类分子结合,提呈给Th细胞识别
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请求专业人士解答内含子lncRNA
Miracle星
lncRNA 的生物功能lncRNA作用范围广泛,机制非常复杂,为了方便大家的理解,我们来简单看看lncRNA的特点:1. 在编码蛋白基因的上游启动子区转录,干扰邻近蛋白编码基因的表达2. 与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,调控基因的表达水平3. 结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性4. 作为小分子RNA的前体分子或者miRNA反义抑制分子5. 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体lncRN
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NF-kB的激活验证
balalaLy
核浆分离提取蛋白,比较核内外蛋白量,提取总蛋白比较磷酸化和非磷酸化
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