大肠杆菌转化提质粒PCR有条带，酶切无条带
dxy_tphcsz00
pet28a为载体，连接目的基因（为了对比做了两个公司的连接酶）导入大肠杆菌DH5α，挑取平板长的单菌落（平板抗性没问题），过夜摇菌提质粒，提的质粒做模板PCR验证和酶切验证，结果是PCR有目的条带，但是酶切几乎都没有目的条带，偶尔十分之一的概率可能会出现一个有目的条带的，请问这是咋回事呢（两个公司的酶做出来都是这样子的）？
是假阳性太多了吗，怎么避免呢？？
3 个回答
高山云初
有帮助
不是假阳性太多，可能是PCR过程中太长，酶切位点发生突变
dxy_tphcsz00
你好，是
PCR时间过长了吗，我的程序是95℃预变性3分钟，变性10s，退火5s，延伸30s，35个循环，然后彻底延伸6分钟，整个循环下来大概需要1个小时25分钟。如果改的话，是不是把循环次数改小一点？？
Keven轩
有帮助
可能是PCR过程中太长，到系统紊乱，酶切位点发生突变
dxy_tphcsz00
你好，是PCR时间过长了吗，我的程序是95℃预变性3分钟，变性10s，退火5s，延伸30s，35个循环，然后彻底延伸6分钟，整个循环下来大概需要1个小时25分钟。如果改的话，是不是把循环次数改小一点？？
dxy_tsaz5wq8
有帮助
建议送测序，可能选择的酶切位点在pcr扩增过程中突变了
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