🔥 大肠杆菌表达系统

将目的基因片段插入特定载体后导入宿主细胞大肠杆菌中诱导其大量表达蛋白质的方法。

原核表达质粒载体的构建→转化到高效表达的宿主菌→目的蛋白的诱导表达→细菌的扩大培养→制备细菌蛋白粗提物→目的蛋白质的纯化。

设计含有 His 标签的目的基因引物，通过克隆手段构建能在大肠杆菌中表达的重组基因质粒载体，随后将质粒转化入大肠杆菌中，通过 IPTG 诱导，大肠杆菌会高表达目的蛋白，将大肠杆菌破碎后，目的蛋白溶解于上清中，Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有 His（组蛋白）标签的碱性蛋白蛋白结合。

在蛋白上柱后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以也可以与咪唑结合，咪唑与 His 标签竞争性结合在 Ni 柱上，因此我们利用低浓咪唑洗脱杂蛋白，利用高浓度咪唑梯度洗脱目的蛋白，收集洗脱液，最后通过透析去除咪唑就能获得目的蛋白。

可用于体外大量纯化目的蛋白，做 pull-down 实验、纯化蛋白产物等等。

1、外源基因的诱导表达

（1）设计含有 His 标签的目的基因引物。

（2）构建目的蛋白与 His 标签的融合基因，连接于大肠杆菌表达质粒当中。

（2）将构建好的质粒转化到相应的大肠杆菌表达系统的宿主菌（如 BL21），涂于液体 LB 培养基上，37 ℃ 过夜培养。

（3）挑取单菌落，接种于 50 ml 液体 LB 培养基，过夜培养。

（4）扩大培养，依据 1:100 的接种量，将菌液接种至大型 LB 液体培养基当中，37 ℃ 培养。

（5）培养条件：根据不同启动子及菌种类型调整蛋白诱导的条件。例如，在 BL21 中表达 T7 启动子的工程菌，菌液浑浊后测量培养液的 OD₆₀₀ 达 0.4~0.6，迅速使温度降至 16 ℃ 进行 IPTG 诱导，诱导浓度为 11 mmol/L，诱导后继续培养 12 h，进行收菌，裂解。

2、大肠杆菌分离与蛋白质纯化

1）细菌的裂解

常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。后三种方法在实验室研究中应用较为广泛，下面主要介绍超声破碎法的实验步骤。

超声破碎法：声频为 15~20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体 DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。

① 收集 1 L 诱导表达的工程菌，4 ℃，5 000 rpm 离心，15 min；弃上清，约每克湿菌加 3 ml 超声缓冲液。

② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌（如超声 4 s，停顿 6 s，功率 40%）；10 000 g 离心，15 min，分别收集上清液和沉淀。

2）镍柱纯化

① 将上清收集过 Ni 柱，二次流穿，收集流穿后的上清。

② 用体积约 100 ml 的清洗缓冲液清洗镍柱

③ 根据实验目的使用相应体积的洗脱缓冲溶液，根据咪唑的梯度洗脱目的蛋白，收集不同咪唑浓度洗脱下的蛋白。此步骤如果再预装柱及蠕动泵中可自动化，无需配置梯度溶液。

④ 可以选用适宜孔径大小的浓缩柱将蛋白浓缩。

⑤ 分别取各个步骤的留样及最后的洗脱下的目的蛋白，加入等体积的 2×凝胶电泳加样缓冲液，进行 SDS-PAGE 跑胶，随后考马斯亮蓝染色检测是否纯化到目的蛋白。

（1）超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经 3~4 次冻溶后更容易破碎。

（2）尽量每个步骤的上清与沉淀都收集起来，最后用 SDS-PAGE 检测样品，能判断出那个步骤实验有误。

（3）根据不同启动子及菌种类型调整蛋白诱导的条件。如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则在 30~32 ℃ 培养数小时，使培养液的 OD₆₀₀ 达 0.4~0.6，迅速使温度升至 42 ℃ 继续培养 3~5 h；如果表达载体的原核启动子为 tac 等，则 37 ℃ 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L。继续培养 3~5 h。

（4）纯化蛋白应根据蛋白特性的不同更改纯化调节，例如应尽量避开蛋白等电点，避免蛋白的沉淀；例如某些蛋白容易降解所以应在低温环境下操作，避免蛋白过快降解；某些蛋白表达较低，可提高 IPTG 工作浓度或增加诱导时间。

蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用 Triton-X100/EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。洗涤液 I 配方如下：

0.5% TritonX-100

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

（1）细胞裂解混合物 12 000 g 离心，15 min，4 ℃；弃上清，沉淀用 9×洗涤液 l 悬浮；室温放置 5 min；12 000 g 离心 15 min，4 ℃；吸出上清，用 100 μl 水重新悬浮沉淀；分别取 10 μl 上清和重新悬浮的沉淀，加 10 μl 2×凝胶电泳加样缓冲液，进行 SDS-PAGE。

（2）包涵体的溶解和复性

① 缓冲液 I：

1 mmol/L PMSF

8 mol/L 尿素

10 mmol/L DTT

溶于前述裂解缓冲液中。

② 缓冲液Ⅱ：

50 mmol/L KH₂PO₄

1 mmol/L EDTA（pH8.0）

50 mmol/L NaCI

2 mmol/L 还原型谷胱甘肽

1 mmol/L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和 HCI。

（2）用 100 μl 缓冲液 I 溶解包涵体；室温放置 l h；加 9×缓冲液Ⅱ，室温放置 30 min，用 KOH 调 pH 到 10.7；用 HCI 调至 pH 8.0，在室温放置至少 30 min； 1 000 g 离心，15 min，室温；吸出上清液并保留，用 100 μl 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取 10 μl 上清，加 10 μl 2×凝胶电泳加样缓冲液，与 20 μl 重新溶解的沉淀进行 SDS-PAGE。