大肠杆菌的转化及重组菌的筛选

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一、 实验目的
学习和掌握转化大肠杆菌 的通用方法，并进行转化子的筛选

二、 实验原理
转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42℃短时间的热激可利于外源DNA转化 ，然后再经过恢复和筛选，选择转化子。

三、实验材料
E.coli (受体) PBS K+质粒DNA

四、实验仪器、器皿及试剂
1．仪器：低温冷冻高速离心机 、恒温水浴箱、超净工作台、冰箱
2．器皿：eppendorf 离心管、微量加样器及Tip 、乳胶手套
3．试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素、0.1mol/l CaCl2溶液

五、实验步骤
1．从甘油保存菌种中接种一环 E.coli至LB平板上，37℃倒置培养过夜。
2．挑取2~3mm直径的单菌落接种至有50ml LB液体培养基的三角瓶中，37℃震荡培养2小时（摇床转速250r/min）当OD590为0.375即可。
3．吸取1.4ml菌液至Eppendorf管， 7000g离心2min，弃上清，并倒置于吸水纸上。
4．重复步骤3一次。
5．将细菌悬浮于1ml预冷的0.1mol /lCaCl2溶液中，置冰浴10min。
6．7000g离心2min，弃上清，收集细菌。
7．将细菌重悬于200μl预冷的0.1mol /l CaCl2 溶液，冰浴30min。
8．每管加入质粒DNA50ng/10μl，轻轻混匀，冰浴放置20min，设一不加质粒DNA的对照。
9．将管置于42℃水浴中2min，不要摇动。
10． 迅速转移至冰浴2min。
11． 加入800μlLB液体培养基，37℃培养45min，以便转化菌表达抗性。
12． 接种到含100μg/ml Amp的LB冷平板上。
13． 将平板倒置入37℃恒温培养箱培养过夜。
14． 确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子。

六、注意事项
1．试剂纯度高是非常重要的，尤其是CaCl2，有时同一厂家出品的不同批号产品，其致敏的感受态细胞转化率也有一定区别，所以应该进行预实验鉴定其致敏效果。
2．贮存的菌株应保存在-70℃，有经验表明，直接从-70℃取出的菌株，培养致敏感后，比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，致敏前应收获对数期或对数生长前期的细菌用于制备感受态细胞。
3．转化实验使用的玻璃器皿，微量吸管及Eppendorf管等，应进行高压消毒。
4．注意无菌操作，防止污染杂菌。