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科研学霸天团，48小时有问必答

问求教用LPS诱导Caco-2 细胞炎症的相关问题？

sci我的

用的什么牌子的lps？为什么我用浓度200μg/ml的染毒48h细胞没有死掉，活的很好？

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问怎样保存2-D凝胶？？

sswei

1 可以把蛋白质斑点先放在硅化的EP管中，放置于4°冰箱保存一个月左右，对蛋白质修饰和结果搜索都没什么大问题；2 可以将蛋白质经过酶解成肽段后再萃取出来，冻干后放置－20°或者－70°保存，直至MALDI-TOF-MS 可以分析蛋白质为止。如果时间长的话，最好放置－70°保存最好；3 看胶上的染色情况，假如是拷染的话，将胶放置时间达到半年也没关系，银染的话，最好染色后立刻取差异点。甚至可以做成干胶

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问关于使用三氯醋酸沉淀法，如何解决蛋白质难于重悬？

loveliufudan

以下是一些可能的解决方案：增加重悬缓冲液的含量：将重悬缓冲液的体积增加，可以减少蛋白质在溶液中的浓度，有利于重悬。通常，可以将重悬缓冲液的体积增加到蛋白质沉淀物的5-10倍。增加重悬缓冲液中的蛋白质还原剂：将重悬缓冲液中的蛋白质还原剂浓度增加，有助于蛋白质的还原和重悬。常用的蛋白质还原剂包括二巯基乙醇（DTE）和二巯基丙酸（DTT）等。增加重悬缓冲液的pH值：增加重悬缓冲液的pH值可以改变蛋白质的

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问使用WB检测TERT蛋白，为什么分子量低于预期，为什么出现杂带！

sswei

分子量比预期低可能是由以下几个原因引起的：细胞提取和蛋白质浓度问题：如果提取细胞的质量和/或数量不足，或者蛋白质提取过程中出现问题，会导致蛋白质的含量不足。这可能会导致目的蛋白的表达水平低于预期。抗体问题：WB实验使用抗体来检测目的蛋白。如果使用的抗体出现问题，例如批次差异或失效，也可能导致目的蛋白的表达水平低于预期。转录后修饰问题：转录后修饰是指在蛋白翻译完成后对蛋白进行修饰，例如磷酸化、乙酰化

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问组织蛋白wb验证，内参跑出来一抹黑

sswei

使用过于粗糙或过于缓慢的洗膜步骤可能会导致高背景值。抗体过时或受损：过时或受损的抗体可能会导致高背景值。蛋白质降解：样品中蛋白质降解可能会导致高背景值。

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问酵母双杂酵母双杂转入ad/bd质粒（作为阴性对照）后二缺板可以生长，在四缺板上也可以生长，是什么原因呀

loveliufudan

如果酵母双杂转入了AD/BD质粒，但在二缺板和四缺板上均可以生长，可能是因为所使用的培养基不同或者酵母双杂的菌株具有一些非特异性交互作用，导致假阳性的结果。一般来说，在二缺和四缺培养基上，酵母双杂只有在正常表达被检测蛋白质的条件下才能生长。在二缺培养基上，只有酵母双杂在同时表达Leu2和Trp1基因才能生长。在四缺培养基上，只有酵母双杂在同时表达Leu2、Trp1、His3和Ade2基因才能生长。

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问免疫共沉淀实验，用裂解液裂解细胞后的液体非常粘稠，离心后也非常粘稠，用2.5微升枪头也没办法吸取上清，怎么办？

loveliufudan

如果进行免疫共沉淀实验时，裂解液非常粘稠，可能是因为细胞裂解不彻底或者存在大量的DNA或RNA等高分子物质，导致样品粘稠。这种情况下，可以尝试以下几种方法：1.调整细胞裂解条件：可以尝试更改裂解液的pH值、NaCl浓度、甘油浓度、Triton X-100浓度、EDTA浓度等条件，以优化细胞裂解效果。如果使用冷冻切割法等机械方法裂解细胞，则需要对样品制备过程进行优化。2.增加离心时间或速度：可以将样

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问为什么包病毒收的上清液很黄，但是离心完的上清液很红？

loveliufudan

黄色的上清液可能是由于胆固醇等脂质类物质或者其他代谢产物的积累导致的。如果在48h和72h收上清液时都出现了这种情况，可能与细胞类型和病毒载体有关。至于上清液离心后呈现红色，并且病毒沉淀很少，这可能是由于以下原因：剩余血清的影响：如果病毒载体中残留了较多的血清成分，在病毒沉淀时可能会与病毒一起沉淀下来，从而使上清液呈现出红色。此外，血清的蛋白质和其它成分可能会干扰病毒的沉淀和浓缩。病毒的沉淀能力：

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问Western Blot内参不齐有什么方法可以改善？

汤姆卜丽波

首先做好定量，按照标准曲线加内参，少的多加点，如果还是不齐，那就可能是内参不对，换一个内参

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问硫酸铵溶解度25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升。分子量为132.12，怎么算的！求解？

loveliufudan

硫酸铵的分子量为 132.12 g/mol。饱和溶液的浓度为 4.1 M，即 4.1 mol/L。饱和溶液的密度为 767 g/L。根据浓度和分子量的关系，可以计算出每升溶液中硫酸铵的质量为：4.1 mol/L × 132.12 g/mol = 542.292 g/L因此，1 L 饱和溶液中硫酸铵的质量为 542.292 g。由于饱和溶液的密度为 767 g/L，因此 1 L 饱和溶液的体积为：1

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问western blot跑出来的内参总是不齐，可能会是啥原因呢？

土井挞克树

可能是上样量不同不均匀，调整上样量再跑，还可能是分离胶浓度太高，可以调整分离胶浓度再跑

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问WB结果不对也不知道原因。

loveliufudan

由于你提到同样的样品在立春红染色中也出现了类似的结果，只有一条泳道正常，那么很可能是样品中的蛋白质含量或质量的问题导致的。以下是一些可能的原因：蛋白质含量不足：如果样品中的蛋白质含量不足，那么Western blot检测时就可能出现很弱或无法检测到的条带。可以尝试增大加载样品的量，或者使用更敏感的检测方法。蛋白质质量不佳：如果样品中的蛋白质质量较差，那么就可能会导致不同泳道之间的信号强度差异很大。

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问给位大神，膜成了这个样子是怎么回事啊，感谢解答！

sswei

可能存在转膜电压过高，解决办法降低转膜电压。

3 回答351 围观

问目的蛋白是否外泌出细胞外的验证

汤姆卜丽波

如果你的目的蛋白太少了其实wb很难检测到，可以用elisa试试，你也可以把细胞沉淀也试试

3 回答441 围观

问WB检测GFP融合蛋白，条带大小不对

loveliufudan

可能是由于以下几个原因：目的蛋白融合GFP后的蛋白质折叠发生改变，导致抗体无法识别目的蛋白的特异性表达区域。这种情况下，建议尝试更换抗体，或者使用不同的抗体进行检测。目的蛋白融合GFP后的蛋白质含量较低，导致条带大小与GFP相似。这种情况下，可以尝试增大加载样品的量，或者使用更敏感的检测方法。目的蛋白融合GFP后的蛋白质降解或者聚集，导致条带大小发生改变。这种情况下，建议在提取过程中加入蛋白酶抑制

3 回答2942 围观

问WB条带比预测分子量大，公司建议去糖基化

橙汁儿青柠味

首先蛋白条带过大可能是存在修饰，但得确定是否是糖基化修饰，提完的蛋白按照它这个步骤操作是可以的

2 回答1136 围观

问组织里的蛋白ip不下来

橙汁儿青柠味

那有可能是蛋白量不够或在IP处理过程中样品丢失了

4 回答653 围观

问跑WB时内参跑不出来？

橙汁儿青柠味

样品应该是浓度太低，导致测不到条带。首先分批次收货的样品可以暂存-80，等全部收获后一起做蛋白定量，然后加buffer煮沸之后再进行分装冻存于-80

3 回答3921 围观

问WB细胞蛋白取样后直接煮了放-20℃，隔几个星期后跑内参没有条带，加了蛋白酶抑制剂，还是降解了吗？

橙汁儿青柠味

应该是降解了，蛋白保存建议放-80，-20只适合短期保存

4 回答1535 围观

问糖基化修饰

loveliufudan

一种常用的方法是使用Western Blotting对样本中的GICNAC进行检测。可以用特异性抗体对GICNAC进行识别，并通过Western Blotting技术来检测抗体与GICNAC的结合情况。如果阳性组中GICNAC的含量确实显著降低，那么在Western Blotting图谱上，相应的GICNAC带应该会出现减弱或消失的信号。另外，还可以考虑使用其他的生化方法来对样本中的GICNAC进

1 回答599 围观

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