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科研学霸天团，48小时有问必答

问需要在大肠杆菌中构建融合蛋白表达系统，并将目的蛋白分泌至培养基中，应该如何设计基因表达线路？

dxy_mqg1dtg8

在大肠杆菌中构建融合蛋白表达系统可以采用以下基本步骤：1. 选择适当的载体。载体需要包括启动子、转录终止子、选择标记等元件。常用的载体有pET、pBAD、pGEX等。2. 将目的蛋白基因与载体连接。可以使用PCR扩增目的蛋白基因，然后将其与载体连接。连接方法可以采用限制性内切酶切割、Ligase连接等方法。3. 构建融合蛋白。可以将目的蛋白基因与表达载体中的某个蛋白基因连接，从而构建融合蛋白。4.

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问可以用Elisa试剂盒测植物的酶活吗

土井挞克树

可以的，elisa可以测植物酶活。

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问菌液提蛋白也是用BCA法测蛋白浓度吗？

麻黄连翘赤小豆

可以的，测蛋白浓度就可以用BCA法，或者直接用蛋白定量仪

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问WB，PVDF膜显影呈磨砂，颗粒状

loveliufudan

当在Western Blot显影后，PVDF膜呈现完全白色并具有颗粒感时，可能存在以下原因之一： 1. 过度曝光：过度曝光会导致所有区域的蛋白条带变得非常明亮，甚至超出线性范围。这可能会导致整个膜呈现一片白色。尝试减少显影时间或降低显影剂的浓度以避免过度曝光。 2. 背景信号过高：可能存在较高的非特异性背景信号。这可能是由于抗体结合不特异性的蛋白或试剂中存在的污染物引起的。确保使用高质量的抗体，并

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问WB曝光的时候只有marker条带，是怎么回事，其他的蛋白都条带一点没有，重做一遍结果一样，是什么原因？

loveliufudan

当在Western Blot实验中只观察到marker条带而没有其他蛋白条带时，可能存在以下原因： 1. 样品加载量不足：确保您在加载样品时使用足够的蛋白量。如果加载量过低，可能导致蛋白条带无法被检测到。尝试增加加载量以获得更明显的蛋白条带。 2. 蛋白转移问题：确认蛋白成功转移到膜上。检查转膜的效率，确保蛋白在电泳过程中正确地转移到膜上。您可以使用Ponceau S染色或其他蛋白质染色方法来验证

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问加入loading buffer后再重新蛋白定量影响有多大。

麻黄连翘赤小豆

重新蛋白定量肯定不准，且没有必要，溴酚蓝是一种常用的电泳指示染料，蛋白定量一般在加loading buffer之前

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问IPTG诱导大肠杆菌实验中，大肠杆菌培养多久可加IPTG进行诱导？

Eule科研顺利

摇到OD=0.6-0.8之间加入IPTG

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问如何确立高效液相色谱法测定有关物质的方法？

凌晨三点Dxy

确立高效液相色谱法测定有关物质的方法需要以下步骤：确定检测目标：确定需要测定的物质，如药品、食品、化妆品等。选择色谱条件：根据目标物质的特点，选择合适的色谱柱、流动相、流速等条件。确定检测波长：选择合适的检测波长，通常选择最大吸收波长或者常用波长。制备标准溶液：制备目标物质的标准溶液，并确定标准曲线。进行样品处理：将样品进行处理，如过滤、萃取、浓缩等。进行色谱分析：将样品注入色谱柱，进行分离分析。

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问western blot 用牛奶封闭和BSA封闭有什么区别？什么时候用BSA封闭？

feixue7758527w

我还是觉得脱脂牛奶封闭更适合普通WB实验的，BSA比较贵，对于牛奶封闭后背景比较杂或者信号高的，可以考虑BSA封闭的。

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问ITC实验，结果请教！

sswei

ITC实验中的配体或者受体遭到杂质的干扰。

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问液相实验中，对照品溶液的制备是如何制备的？比如绿原酸标准品，制成每1ml含有多少mg的绿原酸？这些都是根据什么来的？

sswei

需要配制绿原酸标准品溶液，可以按照以下步骤进行：1. 准备所需材料：绿原酸粉末、去离子水、容量瓶、移液管等。2. 称取适量的绿原酸粉末，根据需要的浓度和体积计算出所需的质量。3. 将绿原酸粉末加入容量瓶中，加入适量的去离子水，摇匀溶解。4. 加入足够的去离子水，使溶液体积达到容量瓶的刻度线。5. 用移液管将溶液充分混合，确保溶液均匀。6. 最后，用标准量筒或移液管取出所需的体积，即可得到所需浓度的

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问包涵体复性后颜色偏棕色?

土井挞克树

考虑是包涵体之前就有色素沉着或污染，与操作过程关系不大

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问WB求助

feixue7758527w

我觉得还是制胶的时候那个孔没弄好，否则其他条带不错，这个好像不行的，冲洗一下加样孔试试

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问毕赤酵母诱导表达

dxyc42u

一般是吸取上清的，需要超声破碎的

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问WB显色内参（42kd)的条带很清楚，目的（34kd)条带没有,但是目的条带上的marker出来了

dxyc42u

应该是目的蛋白太少了，排查下看看目的蛋白有没有降解

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问原核表达胶图

晓雨知春来

如果量少的话可以直接选择大肠杆菌表达系统。

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问求助，液相基线不平

dxyc42u

很多时候，水的质量有问题。换水，抽滤。

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问请大家帮忙，WB条带分析

feixue7758527w

我觉得还是建议延长封闭时间，减少转膜时间，保证转膜的时候冰块充足的。

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问WB电泳晕开了是什么情况

麻黄连翘赤小豆

胶的问题，可能是浓缩胶和分离胶的tris-HCl的ph有问题也可能是电泳液PH问题loading buffer的问题

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问肌球蛋白检测

dxyc42u

通过特异的试剂盒进行反应进行检测

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