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问
WB 没有看到条带是什么原因?
Neuron_Glia
若抗体中有防腐剂,如叠氮钠,会使荧光猝灭;另外,荧光越强,淬灭越快。但是你看不到条带,最可能的原因还是抗体效价较低或浓度不足。
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问
求无进展生存率(DFP)的计算方法?
elite_xy
简单说,就是一个病例从你给他治疗开始算,如果你每2个月做一次随访的话,如果第6个月病例的病情有所发展,那么他的PFS就是4个月。当然有些病人的病例不会有发展,统计一下无发展的人数,除以病例数就可以了
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问
二抗孵完后不及时曝光,应存放在哪里呀?
windy609473269
只要用TBST泡着,放四度冰箱就可以了
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问
蛋白可溶性不好怎么办?
detaibio
对原核表达蛋白的活性有较高需求的话,建议先判断表达条件,对表达条件优化,如降低温度,提高IPTG浓度等;最后再采用包涵体复性的方法来重折叠蛋白
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问
Western 有些抗体不出结果是为什么?
流苏紫光
抗体失效了
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问
关于WB的sample buffer大家看下我的是不是有问题?
小婶客de舅叔
是不是少了点dtt
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问
常用的蛋白纯化技术有什么?怎么在大肠杆菌、细胞中进行表达?
我是金博士
根据你想要表达的蛋白,查找基因,构建到原核载体上,在大肠杆菌中表达,然后进行纯化。
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问
细胞培养上清中的蛋白浓缩后再煮沸,成了豆腐渣一样的东西是为什么?
远航TAJI
说明过表达组培养基中有很多蛋白,分泌性蛋白就是大量存在于培养基,与对照组比较有区别,很正常的啊!我想问,你用什么耗材浓缩的培养基????
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问
上样蛋白量在多少范围内(ug)比较合适啊?
yudengsu
但如果是膜蛋白的话,上样量的多少,我上了75ug都没出
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问
原核表达在包涵体里,该这么提蛋白做纯化呢?
丕龙兄
1.蛋白在包涵体里很常见,原因也很多,你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度,更换表达载体(GST标签有增溶作用,pCOLD低温表达载体…),更换表达菌株;2.如果上述尝试还是不成功,那就只能变性纯化了,用变性剂(如6-8M尿素)溶解包含体,然后过镍柱,这样可以得到大量蛋白,纯化出的蛋白通过透析进行复性,然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系,查文章,用他们的实验方法
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问
蛋白分子量相近能跑两张膜吗?
应用场景
可以,跑两张膜,也可以考虑用一张膜两种荧光二抗检测。
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问
内参结果不均一的原因?
傲气的鸿雁
可能是你蛋白浓度测得不准,导致你加样误差太大。
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问
我最近做western的内参条带特别好,背景也很干净,但是目标蛋白要么没有条带,要么有条带但是背景很脏,为啥呢?
我是金博士
1、内参与目的蛋白用的是相同的二抗吗?2、洗膜3min,5-6次3、背景高,调整二抗浓度4、时有时无,请在转膜后用丽春红染膜
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问
WB 的试剂准备应该自己配制还是买试剂盒?能给点建议吗?
momimimimomi
做WB实验比较花钱的是一抗,国外进口的1支大概在3000元-5000元之间不等(根据你的指标而定),二抗价格相对便宜很多,如果使用荧光二抗的话,1瓶Dylight 2000元的可以使很久。剩下的试剂均可以单独购买,Marker、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白抑制剂最好买进口的,价格可能在1000元-3000元左右(根据公司、规格),剩下买国产的即可,如裂解液、电泳液、电转液、Tris-Hcl、SDS-P
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问
从大鼠股骨中用液氮研磨后提取蛋白也是跟常规的组织提取蛋白用的试剂一样吗?
南瓜先生86
如果是提取核蛋白还需要加提取核蛋白的裂解液
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问
做 Western 的时候,上样时等体积或者等质量上样有什么区别呢?
liudong150
应该都是等质量上样吧,挑成等体积的话跑出来条带会好看一些,个人意见。
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问
beta-actin条带灰度一致,但是宽度不一致?
我是金博士
说明上样量不均匀。
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问
水通道蛋白如何提取呢?
塞舌尔墨宝
提取总蛋白,上样检测,利用特异性抗体就可以把你需要观察的对象区别出来
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问
双向电泳跑不好啊怎么办?
phhcrab
这个实验比较复杂,要做得好有难度,特别是大胶。样品制备是关键,后续的操作也很重要。试剂尽量用好一点的,不要省这个钱。多向做过的前辈取经,还有可以咨询设备厂家(GE或Bio-Rad)的技术支持。
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问
我做了好几次 WB,为什么不是什么条带都没有,就是一片漆黑?
我是橙子橙
一片空白的情况下只有Maker条带
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