实验问答21,893,526 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问电泳，有时抛出两条条带，有时是一条条带，两条条带分子量相差不大，可能是什么原因造成的？

hl16010921

1.电泳的原因，相差不大的蛋白有时没有分开。染色，脱色未到最佳等。就是两条带没分开，或丢失一条。2.样品原因。部分降解，修饰（磷酸化，乙酰化等），相近蛋白的干扰。3.样品原因的话，某一样品结果是不可逆的，一条带变两条，而后该样品一直是两条带。电泳的问题是随机的，忽而一条，忽而两条。4.电泳，问题可能大。稳定电泳条件，特别是防止局部过热。

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问RT-PCR 特异性，实验组和阳性及阴性对照组最后都出现了目的条带是为什么？

hl16010921

1.人或哺乳动物的保守基因可能是操作者带来的污染。（这点很容易被忽视，尤其是老手）2.多样品时加样失误，用排管或板时有时出现。3.试剂或水的污染尤其是公共试剂。4.电泳点样或上样时混入。5.误将引物二聚体当做目的带了（目的带低于100bp时或目的带没出，无marker时可能性大）6.都换新的重做。同时PCR时一定带手套，做实验前拖地，清洁台面，把头发，胡子包一下，不要有人员走来走去。

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问请问， 200kD的蛋白的转膜条件是什么？

小太爷1988

100V 2小时足够了，转膜液70%水，20%甲醇，10%10x转膜液（电转液），至于恒压与恒流哪个好，因人而异吧，各有各的喜好，恒流产热比较少，我习惯恒压转，但是因为电流会随着转膜时间的增长会加大，所以产热会多一些，不过一般没什么问题，把转膜的盒子包在冰里就好，或者有条件觉得话，放在冷室里就行，一般问题不大；如果你想恒流的话250mA2.5小时-3小时应该就可以了。至于小分子的，看你的目的蛋白有

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问蛋白没有表达是啥原因？

大爱蒙奇奇

蛋白不表达可能有很多方面的原因：1：质粒是否成功转化到你的宿主菌。2：改变诱导时机和诱导剂浓度，一般当OD值在0.5-0.6时较好。3：也许蛋白已经表达，只是不是已可溶形式表达的。4：也许是蛋白表达过低，SDS-PAGE不能发现。5：你用的菌错了，要用BL21(DE3).PET22b也的用这个菌。具体的你还得分析，我也不是很了解。

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问WB 没有看到条带是什么原因？

Neuron_Glia

若抗体中有防腐剂，如叠氮钠，会使荧光猝灭；另外，荧光越强，淬灭越快。但是你看不到条带，最可能的原因还是抗体效价较低或浓度不足。

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问求无进展生存率（DFP）的计算方法？

elite_xy

简单说，就是一个病例从你给他治疗开始算，如果你每2个月做一次随访的话，如果第6个月病例的病情有所发展，那么他的PFS就是4个月。当然有些病人的病例不会有发展，统计一下无发展的人数，除以病例数就可以了

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问二抗孵完后不及时曝光，应存放在哪里呀？

windy609473269

只要用TBST泡着，放四度冰箱就可以了

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问蛋白可溶性不好怎么办？

detaibio

对原核表达蛋白的活性有较高需求的话，建议先判断表达条件，对表达条件优化，如降低温度，提高IPTG浓度等；最后再采用包涵体复性的方法来重折叠蛋白

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问Western 有些抗体不出结果是为什么？

流苏紫光

抗体失效了

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问关于WB的sample buffer大家看下我的是不是有问题？

小婶客de舅叔

是不是少了点dtt

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问常用的蛋白纯化技术有什么？怎么在大肠杆菌、细胞中进行表达？

我是金博士

根据你想要表达的蛋白，查找基因，构建到原核载体上，在大肠杆菌中表达，然后进行纯化。

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问细胞培养上清中的蛋白浓缩后再煮沸，成了豆腐渣一样的东西是为什么？

远航TAJI

说明过表达组培养基中有很多蛋白，分泌性蛋白就是大量存在于培养基，与对照组比较有区别，很正常的啊！我想问，你用什么耗材浓缩的培养基？？？？

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问上样蛋白量在多少范围内（ug）比较合适啊？

yudengsu

但如果是膜蛋白的话，上样量的多少，我上了75ug都没出

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问原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

丕龙兄

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株；2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法

1 回答3339 围观

问蛋白分子量相近能跑两张膜吗？

应用场景

可以，跑两张膜，也可以考虑用一张膜两种荧光二抗检测。

1 回答1085 围观

问内参结果不均一的原因？

傲气的鸿雁

可能是你蛋白浓度测得不准，导致你加样误差太大。

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问我最近做western的内参条带特别好，背景也很干净，但是目标蛋白要么没有条带，要么有条带但是背景很脏，为啥呢？

我是金博士

1、内参与目的蛋白用的是相同的二抗吗？2、洗膜3min，5-6次3、背景高，调整二抗浓度4、时有时无，请在转膜后用丽春红染膜

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问WB 的试剂准备应该自己配制还是买试剂盒？能给点建议吗？

momimimimomi

做WB实验比较花钱的是一抗，国外进口的1支大概在3000元-5000元之间不等（根据你的指标而定），二抗价格相对便宜很多，如果使用荧光二抗的话，1瓶Dylight 2000元的可以使很久。剩下的试剂均可以单独购买，Marker、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白抑制剂最好买进口的，价格可能在1000元-3000元左右（根据公司、规格），剩下买国产的即可，如裂解液、电泳液、电转液、Tris-Hcl、SDS-P

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问从大鼠股骨中用液氮研磨后提取蛋白也是跟常规的组织提取蛋白用的试剂一样吗？

南瓜先生86

如果是提取核蛋白还需要加提取核蛋白的裂解液

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问做 Western 的时候，上样时等体积或者等质量上样有什么区别呢？

liudong150

应该都是等质量上样吧，挑成等体积的话跑出来条带会好看一些，个人意见。

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