上样蛋白量在多少范围内（ug）比较合适啊？

我用的是碧云天的BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度的，100mg肝脏加入1mlRIPA裂解液（含10ulPMSF），肝脏组织浓度测得是6.2mg/ml，不过标准曲线的R平方只有0.981。12000g，离心5min，取上清保存至-20度冰箱的。这些操作有问题吗？另外，我配的是2×SDS sample buffer，可是我是先煮蛋白5min再加SDS sample buffer的，所以WB过程中，对胶和膜进行染色都未见蛋白。现在重新取了动物组织，准备测浓度后，再1：1加入2×SDS sample buffer，再沸水中煮5min，不知这次做内参是否能有条带出来。老师，上样蛋白量在多少范围内（ug）比较合适啊？我用的是1.5mm 15孔梳子，上样体积多少ul范围合适呢？