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实验问答23,357,793 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

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蛋白质

问wb 小白求助 E-cadherin 和 N-cadherin 转膜条件和分子量是多少？

丁香实验

E-cadherin是135，一抗的话我们是4℃。转膜的话，我们是恒流，300mA，90min左右

1 回答1139 围观

问显色弱灵敏度低？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因：产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。孵育时间和孵育温度未达到实验要求。洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。底物溶液TM

1 回答433 围观

问花板无梯度背景高是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高，。出现该现象的可能原因：底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。加样时没有换枪头造成交叉污染。花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被

1 回答245 围观

问出现白板现象是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。出现该现象的可能原因：试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。配置稀释液的蒸馏水可能被污染。洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。酶标记物的活性和效价比较低。溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应

1 回答325 围观

问研究人血清中的一个蛋白，目前正在制备单抗。请问在用Elisa检测的时候用什么做标准品好？如果就用合成的重组蛋白是否合适？

丁香实验

首先回答你标准品这个，既然称之为标准品那么就可以作为标准的物质，那么就一定具有一定的溯源性。就实际情况来讲你用重组和天然的都可以，因为这两种在商品化Elisa试剂盒中都有使用。那么基于你这个问题再深入聊聊。首先我们分为两类：一是你想做个Elisa检测仅仅用于你项目或者论文的一部分；二是你是准备做商业化产品。第一种情况，你只需要大致做做，用重组就可以。不用深究；第二种情况，这种情况要求你论证更充分。

1 回答259 围观

问ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

丁香实验

就问题来讲我我认为是这样的体内的Ig的不同形式其实是存在在免疫的不同时期的，或者我们理解为半衰期不同。那么最后起到作用主要还是IgA，其他的都比较少。那么你想排除干扰，这个一般是在你产品的检测系统上下功夫。比如你二抗的特异性等。纯粹去除的，并且简单可行的我没遇见过。

1 回答491 围观

问WB 敷牛奶需要多长时间？

wangyx520

一般采用 5% 牛奶封闭，可以 4° 封闭过夜，也可以室温封闭 1-2 小时。我都试过，没啥区别。

40 回答27908 围观

问为什么 WB 有荧光，但曝光失败？

yunzhongmanbu555

我觉得很可能是显影液的问题。新鲜的显影液应该是淡黄透明，如果变成酱油色就尽量别用了。以前我就遇到过这种情况，一换显影液，马上就可以显出了。

11 回答4012 围观

问为什么做的 Western 最后都没有显出影啊？

wuhao88

在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题，第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头，试剂盒污染；第二次是师兄用下来的试剂盒，开封日期已经2年，最后验证是试剂盒失效，换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带，浪费了我半个月时间。我遇到同样的问题是从头找起的：先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白，排除蛋白被降解，如果没有问题，再用考马斯亮蓝染转膜后的膜，可以看到膜上是不是有蛋白，如果还没有问题，就要注意二抗是不是

10 回答7265 围观

问为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致？

dxymuchong

我可以这么理解吗：内参稳定说明上样量稳定（应该大致是一样的），所以不存在什么上样量不一样的问题；出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。只是个人观点。

25 回答30373 围观

问为什么用 ELISA 试剂盒检测样品显色无差异？

jm晶美生物

显色弱灵敏度低。在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因： 1.产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。 2.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。3. 少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。4. 洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。5.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。6.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过

10 回答2930 围观

问为什么 Western Blot 的条带向两边扩散？

larixa

你的胶是失败的，胶的比例有无问题，微波炉加热是否充分，趁热倒胶时是否均匀，冷却凝结时是否静置，冷却时间是否足够。都可能出现小问题。从你的叙述来看，你的胶可能不止一处存在问题。先不要浪费你的样品，先研究一下怎样做出能用的凝胶。

13 回答10290 围观

问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

8 回答5843 围观

问做 WB，一抗和 marker 怎样选取？

xzmcjxj

个人觉得一抗的话是abcam，cell signaling technology,santa cruz,bioworld这几家公司的不错，也比较常用，购买一抗的时候要注意它的试用范围，比如说使用的物种，主要就是H\M\R，指的是人、小鼠和大鼠，还有就是它适合做哪些实验，最常规的就是WB\IF\IMH等。而marker的话就是要根据自己的目的蛋白的大小来决定了，一般选接近的，如果分子量比较小的话就

7 回答6939 围观

问做免疫沉降能否使用不同公司生产的抗体？

changhao6787

能不能做IP要看抗体说明书，有适用范围；磷酸化和非磷酸化MW差不了这么多，基本是一致的，你可以看看sigma是不是对于截短的蛋白跑wb的，具体你目标蛋白的分子量（MW）你可以在NCBI上或是文献途径确定一下，没有要求鼻血用一种公司的抗体进行试验。

6 回答3853 围观

问请问如何提取 IgAN 患者血清中的免疫复合物？

云天昊

离子交换层析法提取IgG　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

1 回答1733 围观

问请问性价比较高的蛋白裂解液推荐什么品牌？

萧莣苼

蛋白裂解液，现在差异不会太大，进口有CST，abcam等等，国产有碧云天，生工，百奇生物等等，不同蛋白裂解液可能不一样。

1 回答928 围观

问血液保存

twoicedragon

将全血离心后取血清-80度保存,全血冻存的话，红细胞会裂解，血清会被红细胞液污染。

2 回答1707 围观

问ECL 试剂盒荧光特别弱怎么办？

hbzwwxclxq

一般ECL发光液我们实验室是在用之前从4度取出配好需要的量，然后马上放回4度冰箱，很多人是拿出来一直常温下放着等曝完光再放回冰箱，这样可能就会影响到效果哦，还有就是注意有效期吧。。。。

6 回答3040 围观

问原核表达目的蛋白分子量小于GST标签蛋白是为什么？

detaibio

原核蛋白表达与纯化实验所表达的目的蛋白大多数是以包涵体的形式表现，有些蛋白可以通过降低温度，加快实验速度来改变表达情况，使蛋白表达为可溶性上清蛋白，但是最有效的还是做包涵体复性，这是比较稳妥的，可获得可溶性蛋白的方法，只是活性上会有所降低。

3 回答4084 围观

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