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科研学霸天团，48小时有问必答

问wb新手求助，image lab曝光scn格式如何转换成tif格式？

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问WB 点样孔有残留，跑出的条带就变形了，这是怎么回事呢

丁香实验

我老师说出现这种情况在水浴5-10分钟试试

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问ChIP中input的问题

bob523740605

我最后做的是Qpcr ，数据分析的时候是一input为基准的分析，通过一个excel表分析http://http://d.dxy.cn/detail/4076728

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问【原创】Western blot 之制胶技巧，易翻车点及其解决方法汇总

丁香实验

说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。今天我们就来探讨一下制胶这个事。一、SDS PAGE 凝胶制备1、玻璃板梳子的清洁先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或

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问wb 小白求助 E-cadherin 和 N-cadherin 转膜条件和分子量是多少？

丁香实验

E-cadherin是135，一抗的话我们是4℃。转膜的话，我们是恒流，300mA，90min左右

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问显色弱灵敏度低？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因：产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。孵育时间和孵育温度未达到实验要求。洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。底物溶液TM

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问花板无梯度背景高是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高，。出现该现象的可能原因：底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。加样时没有换枪头造成交叉污染。花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被

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问出现白板现象是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。出现该现象的可能原因：试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。配置稀释液的蒸馏水可能被污染。洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。酶标记物的活性和效价比较低。溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应

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问研究人血清中的一个蛋白，目前正在制备单抗。请问在用Elisa检测的时候用什么做标准品好？如果就用合成的重组蛋白是否合适？

丁香实验

首先回答你标准品这个，既然称之为标准品那么就可以作为标准的物质，那么就一定具有一定的溯源性。就实际情况来讲你用重组和天然的都可以，因为这两种在商品化Elisa试剂盒中都有使用。那么基于你这个问题再深入聊聊。首先我们分为两类：一是你想做个Elisa检测仅仅用于你项目或者论文的一部分；二是你是准备做商业化产品。第一种情况，你只需要大致做做，用重组就可以。不用深究；第二种情况，这种情况要求你论证更充分。

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问ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

丁香实验

就问题来讲我我认为是这样的体内的Ig的不同形式其实是存在在免疫的不同时期的，或者我们理解为半衰期不同。那么最后起到作用主要还是IgA，其他的都比较少。那么你想排除干扰，这个一般是在你产品的检测系统上下功夫。比如你二抗的特异性等。纯粹去除的，并且简单可行的我没遇见过。

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问WB 敷牛奶需要多长时间？

wangyx520

一般采用 5% 牛奶封闭，可以 4° 封闭过夜，也可以室温封闭 1-2 小时。我都试过，没啥区别。

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问为什么 WB 有荧光，但曝光失败？

yunzhongmanbu555

我觉得很可能是显影液的问题。新鲜的显影液应该是淡黄透明，如果变成酱油色就尽量别用了。以前我就遇到过这种情况，一换显影液，马上就可以显出了。

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问为什么做的 Western 最后都没有显出影啊？

wuhao88

在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题，第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头，试剂盒污染；第二次是师兄用下来的试剂盒，开封日期已经2年，最后验证是试剂盒失效，换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带，浪费了我半个月时间。我遇到同样的问题是从头找起的：先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白，排除蛋白被降解，如果没有问题，再用考马斯亮蓝染转膜后的膜，可以看到膜上是不是有蛋白，如果还没有问题，就要注意二抗是不是

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问为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致？

dxymuchong

我可以这么理解吗：内参稳定说明上样量稳定（应该大致是一样的），所以不存在什么上样量不一样的问题；出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。只是个人观点。

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问为什么用 ELISA 试剂盒检测样品显色无差异？

jm晶美生物

显色弱灵敏度低。在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因： 1.产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。 2.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。3. 少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。4. 洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。5.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。6.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过

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问为什么 Western Blot 的条带向两边扩散？

larixa

你的胶是失败的，胶的比例有无问题，微波炉加热是否充分，趁热倒胶时是否均匀，冷却凝结时是否静置，冷却时间是否足够。都可能出现小问题。从你的叙述来看，你的胶可能不止一处存在问题。先不要浪费你的样品，先研究一下怎样做出能用的凝胶。

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问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

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问做 WB，一抗和 marker 怎样选取？

xzmcjxj

个人觉得一抗的话是abcam，cell signaling technology,santa cruz,bioworld这几家公司的不错，也比较常用，购买一抗的时候要注意它的试用范围，比如说使用的物种，主要就是H\M\R，指的是人、小鼠和大鼠，还有就是它适合做哪些实验，最常规的就是WB\IF\IMH等。而marker的话就是要根据自己的目的蛋白的大小来决定了，一般选接近的，如果分子量比较小的话就

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问做免疫沉降能否使用不同公司生产的抗体？

changhao6787

能不能做IP要看抗体说明书，有适用范围；磷酸化和非磷酸化MW差不了这么多，基本是一致的，你可以看看sigma是不是对于截短的蛋白跑wb的，具体你目标蛋白的分子量（MW）你可以在NCBI上或是文献途径确定一下，没有要求鼻血用一种公司的抗体进行试验。

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问请问如何提取 IgAN 患者血清中的免疫复合物？

云天昊

离子交换层析法提取IgG　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

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