为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

一抗或二抗浓度太高都有可能引起曝光时胶片发白，在降低其浓度的情况下，还可以适当降低上样量或者底物不需要用plus的，用灵敏度较低的底物

曝光过度，和封闭没有太大关系。降低一抗或二抗浓度、上样量、抗体孵育时间、改用效果不那么强的发光液或稀释发光液或把膜放到甲醇浸泡几秒（用镊子夹住膜在甲醇里涮2-3次）打断ECL和二抗链接，TBST多洗几次，再显色试试。

我上次做内源性蛋白也是一片白，可以考虑封闭的时间，我在4度封闭过夜，效果会好一些。同时考虑一抗和二抗的浓度，我个人观点，一抗的浓度会更重要一些，需要摸索浓度梯度，并且在一抗孵育后，PBST漂洗彻底。

可能是一抗或二抗浓度过高，一抗用1:500太高了，我都用1:1000，有时候还会有些背景，回收利用第二次的时候就没有背景了，二抗先试试1:5000吧，还有就是也要注意TBST的酸碱度，PH最好在7.0~8.0，偏碱了可能有背景，偏酸了也不好

其实主要是抗体特异性不好，跟封闭时间关系不大，封闭大于1h已足够。虽不知抗体效价如何，感觉一抗二抗浓度均较高，且二抗我一般孵育1小时，时间过长容易增加非特异结合。

我们的片子也出现过这样的情况，可能是：1、封闭不好，但可能性比较小，我们实验室是90分钟室温封闭，时间足够。2、二抗浓度和质量不好，建议首先调试一下二抗浓度，如果多种浓度下效果都不好，可以考虑换二抗，其实santa的二抗还是不错的，浓度比较好确定。

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才行，才能保证压片时的效果。（2）下一步做一抗的稀释度，一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件，转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗，孵育进行后续步骤。2、内参做成这样，说明操作上不是很严谨，或者说是整个步骤有问题。3、WB过程是要避免膜干燥的，还有就是在ECL孵育的过程中要避免金属等污染膜，会抑制HRP的活性。

我认为主要原因在于二抗的处理上。首先是浓度过高，导致结合于一抗的二抗过多，造成加入发光底物后条带处底物消耗过快，出现所谓的“反白”。其次，二抗孵育过后洗涤强度或者时间不够，或者最有可能是由于洗膜之后直接发光，导致整个膜都非特异性的均匀结合上了二抗，这个也更加促进了发光底物的耗竭。建议稀释二抗并加强膜的洗涤，祝你获得理想的结果！