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问
coip加入beads之后要mix和wash,是直接用枪吹打好还是用vortex好?
dxy_o38ns7o8
枪吹比较好,涡旋振荡力太大 容易破坏结合力 阳性率降低
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问
ip实验中收细胞前加MG132的目的是什么?什么情况下可以不加?
天雨心晴
看你的实验目的了。因为高浓度处理时间长了,细胞会大量死亡。
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问
请教测trpv1蛋白
TotalA
48kd 6次跨膜蛋白 辣椒素受体蛋白因TRPV1,且具有热敏性,样品处理需要注意,总蛋白提取也需要注意,跨膜蛋白在使用RIPA提取总蛋白时容易丢失,可以选择新型柱式法总蛋白提取,如果条带检测弱,可以考虑进行TRPV1蛋白所在质膜的分离富集后,再行检测,WB检测可能更好。总蛋白上样每孔要30ug-40ug,电泳,转膜,封闭,一抗4度孵育过夜,二抗1小时,显影曝光就好了
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问
做WB实验时遇到高背景、多条带的情况怎么办?
sophomore
首先,高背景,可能是封闭液不是新配制或者可能有其他问题,最好重新配制封闭液,5%BSA或奶粉,商品化的封闭液都可以。而多条带有出现杂带的话一般先考虑有没有抗体特异性的问题,或者是与非目标蛋白结合后,会出现杂带可能。
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问
elispot是不是要检测TB.细胞,需要分离培养淋巴细胞么?这个实验的前期基础怎么做呢
天一湖医者
elispot检测TB.细胞需要分离培养淋巴细胞。ELISPOT检测的是可释放细胞因子的活化T淋巴细胞的数目。ELISPOT方法的基本原理一样,但仍然会有一些变化,包括效应细胞的种类,可以是外周血T淋巴细胞,也可以是体外培养的T细胞。抗原刺激物可以是肽或者蛋白质,抗原呈递细胞有外周血单核细胞、树突状细胞或者肿瘤细胞系,检测的指标可以是各种细胞因子或者颗粒酶B等。
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问
蛋白质SDS-PAGE实验的问题?
Eason老歌迷
目的蛋白条带太弱,有几个原因。可能是你的蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不多。可能是你转膜没转好,没转完全,用丽春红染一下看看。可能是你的抗体稀释浓度太低了,或者是孵育时间太短。也可能是你的显影问题,增加一下显影时间。
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问
电泳100v,30min 120v,40min,转膜60min 封闭5小时,一抗过夜,2抗1h, lc3条带出来不直怎么办
墨幽染染
条带不均匀可能是由于配的胶不均匀导致,因此配胶时要注意配胶用的小烧杯,水,SDS,Tri s,等等干净无杂质,贴边角加入液体,凝固时避免大幅度动作,保证配出来的胶均匀无杂质
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问
原核表达蛋白诱导问题?
申东熙老伯
如果未+IPTG与+IPTG组诱导结果没有差别的话,很有可能蛋白直接没有诱导出来,换个载体重新构建质粒导入新的感受态细胞试着再诱导一下看看,诱导温度和转速还有时间一般不会对诱导结果造成太大差异。
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问
镍柱层析后收集蛋白溶液怎么保存?
bamboopiggy
pbs透析后,放-80保存就可以。不要反复冻融
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问
蛋白无活性
bamboopiggy
你是用什么方法判断活性的呢?裂菌后,活性跑到沉淀中去了,感觉是不是形成包涵体了?
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问
为什么显影时除了目的蛋白,背景中的其他蛋白也有些显影?
balalaLy
一个可能是抗体浓度高,适当降低一抗浓度,另一个可能是抗体用的次数多,重新配一支实在不行就得重新买抗体了
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问
提蛋白的时候ripa和pmsf 的比例弄错了,弄成了10:1,
inventbiotech
没啥影响,就是有点浪费蛋白酶抑制剂
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问
想问一下wb对称得条带围着一个中心变浅是因为什么原因呢?
balalaLy
可能是转膜的夹子夹不均匀,导致中间部分比较松,没有把所有蛋白都转到膜上面去
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问
TLC问题
天一湖医者
最有可能的就是展开板不均匀,薄厚不均一,或者有气泡存在
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问
实验技术丨求助考马斯亮蓝染胶结果疑问
inventbiotech
蛋白降解不像,降解成弥散装。70kd附近条带跟血清白蛋白很像,如果是组织样本可能是血清污染,如果是细胞样本,可能是培养基血清污染,对样本进行清洗应该可以去除污染。最下方是没有区分开的条带,可以用梯度胶进行分离,效果会好一些
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问
阻断ELISA
yaonan120
1.是不是阻断剂效果不好呢2.这种情况可以说是灵敏度的问题吧,标记那边是否可以降低标记量。3.降低空白,稀释液中加点BSA可以降低空白。希望可以帮到你
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问
WB为什么这么难做,一时有条带,一时没有
inventbiotech
WB其实也是一个很灵敏的蛋白检测技术。蛋白样品提取时产生的偏差会导致条带一时有一时无,尤其时目前大家常用RIPA来进行总蛋白的提取,当目标蛋白处于细胞核,细胞器,细胞膜上,这些蛋白在RIPA提取总蛋白时,细胞核因为裂解的不充分核不破或者是裂解特别大染色质打开样品粘稠核内一些蛋白依然不能释放,细胞器和细胞膜上的蛋白因为是膜蛋白脂质层包裹在RIPA裂解液中溶解度有限,尤其是跨膜蛋白这种问题就更为突出,
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问
WB曝光后发现无目标条带,但内参条带比较好的原因有哪些
inventbiotech
这种情况可以说明WB操作没问题,需要考虑目标蛋白一抗,目标蛋白如果是外源性表达,需要找一下表达条件,载体。内源性表达,就需要考虑蛋白提取的时候是不是提取出来了,尤其是表达在细胞核细胞器和细胞质膜上的蛋白。提取时如果是用RIPA提取的,很容易将这些部位的蛋白丢失在RIPA的不可溶性组分里。还有一种情况就是这个目标蛋白表达丰度特别低,需要针对于所在部位进行富集再行WB检测
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问
小鼠肺洗液怎么做Elisa,稀释方法和血清一样么
bamboopiggy
稀释方法是一样的,但是要做个预实验看看需不需要稀释
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问
求助大家做WB电泳液和电转液重复使用几次
inventbiotech
电泳液内槽每次都是新的,外槽2-3次,电转液重复用不好吧
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