做WB实验时遇到高背景、多条带的情况怎么办？

首先，高背景，可能是封闭液不是新配制或者可能有其他问题，最好重新配制封闭液，5%BSA或奶粉，商品化的封闭液都可以。而多条带有出现杂带的话一般先考虑有没有抗体特异性的问题，或者是与非目标蛋白结合后，会出现杂带可能。

a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。

b.封闭液是否会与抗体反应：这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，可能会产生封闭液与磷酸化抗体有非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。

c.封闭时间不够：增加封闭时间也可以降低高背景值的结果，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。

抗体的特异性不好或者是蛋白降解

高背景有可能是膜上的抗体没洗干净，多条带是杂带的话是抗体特异性低，与非目的蛋白结合出现条带。

换用nc膜，或者是降低孵育抗体的浓度。

换新鲜的封闭液， 如果是奶粉一定要充分溶解。同时降低抗体浓度。

WB实验时遇到高背景常见原因及解决方法

高背景，多条带，可能是因为你的抗体特异性不高，或者是你封闭的时间太短了，可以选择一个特异性高的抗体，或者是增加封闭液浓度和时间。