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科研学霸天团，48小时有问必答

问反转录实验之前如何分析RNA样品符合实验要求？逆转录完成的DNA怎么知道满足做qPCR模板的要求？

迟C迟

1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸

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问荧光素酶互补实验验证蛋白互作的载体图谱以及酶切位点

bamboopiggy

仅供参考，不知道你手里质粒的名称，只能猜测是这个俩个吧

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问qpcr无模板阴性对照出现 CT 值时，目的基因的 CT 值是否还能用？

dxywode

有可能的，因为CT值越小，基因表达就越高，所以还是有可能的。你要是觉得不放心可以做一个重复实验。

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问qPCR实验中Ct值是什么意思？有什么作用？怎么看？

天一湖医者

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不

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问q PCR为什么一定要跑溶解曲线？在数据分析这一部分也用不到溶解曲线。

天一湖医者

用来判断产物是否相对专一。溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性。

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问如何有效分析RNA-seq的结果?

天一湖医者

可运用转录水平分析RNA-seq数据的一个重要用途是基于短RNA-seq读数恢复全长mRNA转录物结构和表达水平。目前有许多计算工具同时执行转录重建和量化。1、基于似然法的分析方法。第一种类型的转录物定量方法通过基于统计模型最大化可能性或后验来估计转录物丰度。这些方法是灵活的，并且可以容易地修改以将先前的生物信息结合到后部以提高量化准确性。统计模型进一步分为三类：基于区域的，基于读的和基于片段的模

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问TaqMan 探针荧光定量 PCR 的原理是什么？

dxywode

在Taqman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭

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问如何更好的设计RNA引物？

bamboopiggy

1.根据文献，尤其是高分文献发表的引物。2.可以用公司网站提供的序列，尤其是thermo公司的。3.primerbank直接搜

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问qpcr实验每次平行的扩增曲线都相差很大，怎么解决？

bamboopiggy

1.保证样品融化完全，混匀，且用同一个白枪尖上样。2.保证qpcr mix和引物及水混匀良好。3.复孔之间上样后，高度一致，4.盖好膜，扩增完成后，复孔的高度还要一致，没有蒸发

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问提取RNA后反转录跑PCR电泳阳性对照没有条带？

水行船

阳性对照是什么，整个实验流程描述一下，信息太少了题主：阳性对照是FLAG ，DSP但是一条带都没有，是不是我提RNA，或者是反转录哪里出问题了，求解。

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问如何选择反转录PCR的内参？

cloud-clone

你的内参选择稳定是兔抗鸡GAPDH或B-ACTIN的抗体了。内参抗体实质就是一个一抗。

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问PCR引物特异性不够好，又没什么好的方法来避免呢？

黑布林的大狸子

看不见电泳图，猜一下情况吧1.如果电泳图上有你想要的条带，直接切取相应条带，做琼脂糖凝胶回收就好了（天根有卖），这个片段只会有你引物的两个结合位点，然后用作模板再扩增就行了。2.如果没有目标条带，可以尝试提高退火温度，也可以考虑换引物ps.如果题主只是想做检测的话，加条探针就好了。

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问PCR退火温度应该怎样设定？

luoxinlong

根据我的经验, 如果上下引物Tm值差不多的情况下,退火温度设定比Tm 低三度就可以。但如果两者想差比较大,差5度以上吧,有两种策略,取中间温度,或者进行梯度PCR. 梯度PCR很靠谱的,他的温度设定: 低温=低的Tm-3 高温=高的Tm+3。梯度PCR 你一般拿不到条带的话就要考虑引物和模板的问题了。

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问如何看QRT-PCR 结果中的Cq值？

丁香实验

新版的软件都叫Cq值，不叫Ct值了，不必理会。Ct值15－25是最好，10－30之间也接受。如果超过30了，得看一下复孔是否一致，如果一致，也接受。如果不一致，基本就是废的。

2 回答2136 围观

问血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因？

丁香实验

血浆 -是将新鲜血液加抗凝剂后离心析出的上清液.（血细胞沉降下去了），血液提取RNA 应该是在白细胞中提，首先血液中的RNA本身就少，血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分，自然更少，前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出

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问RNAi用于检验,可行吗？

hzdlj

上几周开会的时候听见了中山二院的宋尔卫研究员讲的RNAi干扰技术,加上我一直很感兴趣,也在看一些文献.会上,我请教过他这个问题,宋老师说他还没有想过这个问题(宋老师很谦虚,听他的讲座受益非浅),不过他向我说起了一个实验模型,就是把siRNA固定在一个固相载体上,然后加入肿瘤细胞,当然siRNA是针对肿瘤细胞的耐药基因设计的,培养细胞加入化疗药物,观察哪些细胞成活了,成活了的,显然不携带耐药基因,没

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问都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？

丁香实验

RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后

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问RT－PCR在RNA干扰中是否还有作用？

zhuqueleee

我觉得你的方法有点问题的。你不应该仅仅通过观察RNAi前后实验组、空白组的cDNA含量变化来监测RNAi效果，而是应当把空白组和实验组再各设一个看家基因对照，通过看家基因和目的基因的量的对比，从而观察你的RNAi效果。个人意见，希望对你的实验有所帮助。

3 回答520 围观

问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

1 回答1214 围观

问设计好的引物如何在NCBI 上比对?

goleo

引物比对在ncbi主页www.ncbi.nlm.nih.gov/上点blast，然后选择左上角那个版块里的search for short，nearly exact matches，输入上游引物序列，在下一行输入下游引物序列，选择你要看的种属（没有特殊要求就选择nr），点submit，在下一个窗口中点format，就可以了。这样是看一对引物的特异性。

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