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        PCR引物特异性不够好,又没什么好的方法来避免呢?

        相关实验:引物设计和末端标记实验

        user-title

        MikeXio

        最近做反扩,原本想得到这样的一段反扩片段:

        img

        想要得到的

        可是正反引物都有两个结合位点,结果就是下面这样一共扩增出来两段非常亮的条带:

        img

        胶图

        img

        实际上得到的1

        img

        求助大佬们给一些建议,换一个怎样的新方法可以把这个反扩载体得到呢?

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        2 个回答

        user-title

        黑布林的大狸子

        有帮助

        看不见电泳图,猜一下情况吧

        1.如果电泳图上有你想要的条带,直接切取相应条带,做琼脂糖凝胶回收就好了(天根有卖),这个片段只会有你引物的两个结合位点,然后用作模板再扩增就行了。

        2.如果没有目标条带,可以尝试提高退火温度,也可以考虑换引物

        ps.如果题主只是想做检测的话,加条探针就好了。

        user-title

        jiansu123

        有帮助

        估计要用overlap extension的方法。第一对引物先p laci到mcherry部分,注意在上游引物设计酶切位点和保护碱基。第二对p 另外部分mcherry以及剩下序列,注意上游要有部分序列和第一对引物下游序列相同,下有部分加上酶切位点和保护碱基。然后第三对引物上游是包含第一段上游的保护碱基和酶切位点,下游包含第二段下游的保护碱基和酶切位点

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