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        血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因?

        相关实验:实时定量 PCR 实验

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        丁香实验

        各位大大好!我最近在做人体血浆中提取RNA,用的是师姐之前用的试剂盒提的miRNA,我问过试剂盒的技术也可以用来提lncRNA,师姐的经验是OD大于1.3以上都是可用的,我实验刚开始时用的血浆提取RNA(新手刚开始做,浓度只有10+ng/ul)逆转录以后跑QPCR可以跑出来,大约试了5/6个样品,还摸索了QPCR体系加1ul 1.5ul 2ul CDNA不同体系的CT值,感觉没有太大差异,内参GAPDH在31/32左右。于是开始提实验组与对照组的血浆RNA继续跑QPCR,提出的RNA浓度在10~80ng/ul不等,260/280在1.4~2.0之间,感觉比摸索条件的时候提取的RNA要好一点,但是内参总是undetermined,目的基因也是时有时无,比内参情况好一点点,但是CT值也很大36/37甚至以上,基本没法看,把QPCR的产物跑胶,发现确实undetermined的孔跑不出东西,有CT值的孔能跑出单一条带,觉得QPCR环节没有问题,然后也跑了一次RNA胶想看一下RNA的完整性,但是发现跑不出来,即便是Q出来的样本也跑不出RNA胶,可能是含量太低了,引物也绝对没有问题,因为之前在细胞RNA环节都是使用的这种引物,最后始终找不到原因,想来园里寻求一下大家的帮助!有没有遇到类似问题的大大们!或者我的环节中还有问题?
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        1 个回答

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        丁香实验

        有帮助
        血浆 -是将新鲜血液加 抗凝剂后离心 析出的上清液.(血细胞沉降下去了),血液提取RNA 应该是在白细胞中提,首先血液中的RNA本身就少,血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分,自然更少,前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出
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