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        PCR退火温度应该怎样设定?

        相关实验:实时 PCR 实验

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        丁香实验

        设计出的上下游引物最低Tm值为53.8度,考虑Tm值的范围在3-5度变动,因此设定的最低温度为48度。但是,PCR后电泳时未检测到条带,marker可跑出条带。之后又改变了退火温度为47度,出现了条带。但是进行二次PCR电泳时,证实了之前跑出的条带是假阳性。

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        2 个回答

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        luoxinlong

        有帮助

        根据我的经验, 如果上下引物Tm值差不多的情况下,退火温度设定比Tm 低三度就可以。但如果两者想差比较大,差5度以上吧,有两种策略,取中间温度,或者进行梯度PCR. 梯度PCR很靠谱的,他的温度设定: 低温=低的Tm-3 高温=高的Tm+3。

        梯度PCR 你一般拿不到条带的话 就要考虑引物和模板的问题了。

        user-title

        丁香实验

        有帮助

        现在,我们仍然在改变退火温度,请问应该上调温度还是下调温度?上调温度和下调温度在性质上有什么不同?
        ——47度有点低了,如果不知道哪个温度合适最简单的做法就是先选Tm值作为退火温度,做不出就在Tm值上下5度范围调整,出现非特异扩增就提高退火温度。

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