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        反转录实验之前如何分析RNA样品符合实验要求?逆转录完成的DNA怎么知道满足做qPCR模板的要求?

        相关实验:定量PCR技术

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        dxy_gwqzn660

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        4 个回答

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        迟C迟

        有帮助

        1)检测RNA溶液的吸光度

        280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。1.82.0时,我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是<2.2的)。当R2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。

        2)RNA的电泳图谱

        一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好的。

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        whilt-shirt

        有帮助

        可以通过超微量蛋白核酸检测仪检测RNA的纯度,也就是260nm吸光度与280nm吸光度的比值来判断,基本上在1.7-2.0之间可以用,另外需要检查RNA的浓度,逆转录的过程中RNA最好能有500ng以上。判断cDNA是否满足要求可以通过普通PCR后跑琼脂糖凝胶电泳的方式

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        府宅

        有帮助

        可以通过RNA的电泳图谱

        一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。

        电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好的

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        bamboopiggy

        有帮助

        这个最简单的就是看你的260/280,260/230的比值要在1.8-2.0之间。调节你的rna的样品浓度差不多,一起反转。反转完,只能跑qPCR以后,看结果,才能知道cDNA的质量如何。

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