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科研学霸天团,48小时有问必答
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什么方法可以降低引物二聚体?
balalaLy
降低引物浓度减少循环次数减少模板用量
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问
逆转录形成的c DNA可以振荡离心吗?
汤姆卜丽波
可以涡旋震荡,使样品集中于管底
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问
为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系?
balalaLy
起始模板数越高达到阈值的需要的循环数就越低,根据两者的关系可以建立一条线性方程
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问
内标法和外标法哪种数据更精密?
汤姆卜丽波
如果应用外标法能够满足要求的话,当然首选还是外标法,毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下,用内标法还是必要的。
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问
sybr Green、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择?
Eason老歌迷
还是根据你实验室的条件,和你自己的个人习惯进行选择。我们比较喜欢用sybr green,便宜好用
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问
做多重PCR时,不同基因引物探针之间如何评价质量
bamboopiggy
你可以试试snapgene或者vectorNT,其实你按照引物设计原则:普通的pcr引物设计的软件都可以用,只要使引物的退火温度接近,引物长度应最好 18~24 个碱基。退火温度和循环数非常关键。要尽可能提髙退火温度,要确认每一对 引物单独扩增时的退火温度,然后在多重 PCR 反应时采用最低的退火温度。同样,要采用最少的扩增数。
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问
对照组的bar值怎么做?
bamboopiggy
1.对照组有的文章里就是1,没有bar值,2.如果你实在想要bar值,就把三个对照组的数,取平均值后,三个数和平均数比,得到三个数,这三个数,可以有bar值
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问
以RNA为模版,进行PCR,扩增不出来吗?DNA酶不识别单链RNA吗
秋秋欣欣
PCR是需要用cDNA作为模板进行扩增的,DNA连接酶一般实验室用的是基因改造后的T4DNA连接酶,连接双链DNA以及有粘性末端的DNA片段,不能连接单链RNA.。
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问
探针法多重PCR,扩增时,各条探针平台期荧光信号强度相差大,有必要使信号强度一致吗?
Eason老歌迷
并不需要!但是如果你以后想荧光信号差不多一致的话,可以注意下面的几个点:确保加样的准确性,确保移液的精准度,体系混匀并进行离心,qPCR试剂的选择:选择“预混液”形式的qPCR试剂,反应体系只需加入引物和模板,大大简化实验的操作步骤,减少了加样误差。
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问
多重PCR使用哪些软件可以评价和优化各条引物?
棋NKKP
有很多在线的工具,也可以选择snapgene
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问
模版非常低,反转录时,扩增长片段5K左右,使用oligo dT,还是特异性引物,更容易扩增出来?
未来9
一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾,且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT;基因特异性引物适用于与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况.。
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问
pcr扩增时Taq酶的选择有哪些要点?
Wcrystay
特异性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等等
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问
PCR特异反应出现假阴性(无扩增产物)现象:正对照有条带,样品无条带 的可能原因
n0y0j7
正对照有条带,说明体系正常,唯一不同就是模板,提取浓度低,或者纯化不完全,含有抑制剂。
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问
模板浓度,引物浓度如何摸索?
天一湖医者
常用浓度是10uM/L也就是10pM/L.这样的话,20ul体系加1ul,50ul体系加2ul。
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问
没有CT值出现,可能原因有哪些?
天一湖医者
反应循环数不够 一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45循环), 但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解 避免样品制备中杂质的引入及
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问
换新的一管酶,做实时荧光定量复合扩增的HRM曲线总是发现内参跑的不好,峰很低是怎么回事?
bamboopiggy
是不是你内参的引物用的时间比较久坏了?
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问
PCR体系中的Mg2+有什么作用?
dxy_1lrncmke
Taq DNA聚合酶进行热激活。
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问
关于细菌PCR电泳时候选择内参问题
未来9
细菌的内参常选用16S ;内参表达稳定,所以选择这个基因为基础,做矫正.在相同细菌量上比较目的基因的表达才是可信的结果
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问
qPCR实验重复性问题
天一湖医者
是的,首先qPCR不是很准,特别是对于新手来说。其次,三个平行以上才具有统计学意义,三个生物学重复以上才具有生物学意义。(发表文章时需要)最好能够设置3个复孔,同样的实验再重复3次以上才有可信度.不同的孔之间的差异不要大于0.4-0.5为有效,否则肯定是加样过程出了问题.
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问
荧光定量PCR反应预变性的目的是啥?
bamboopiggy
为了使dna双链更好的打开,跟primer结合
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