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人群PCR
Eason老歌迷
先均一化数据,去除误差,然后在计算
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问
以质粒为模板的pcr克隆线性化载体pcr不出来怎么办
天一湖医者
如果你以质粒为模版扩pcr,然后跑胶时还能看到质粒的条带,那说明你的模版量太大了。降低模版量至最多20ng应该可以了,一般我实验中都用1-10ng就够了,而且这还是50ul体系,如果你的体系更小,我想最多1ng就够了
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问
禽流感病毒rt pcr产物跑胶
汤姆卜丽波
你的rtpcr是正常的?但是跑条带跑不出来?是不是表达量不高,这样也跑不出来。
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问
实时荧光定量PCR条件摸索
balalaLy
cDNA稀释倍数不用太纠结,一般都是按照1:10或者1:20这样稀释,如果需要做的基因数量不是很多,就按1:10,最好按照固定的比例,比如逆转录用500ng或者1000ng的总RNA,然后用1:10这样的比例稀释cDNA,这样你不同批次的实验之间进行对比也比较合理
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问
科研问题请教
秋秋欣欣
产品纯化后,任意一种酶都可以自动在后面加a
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问
QT-PCR实验技术操作中的数据误差分析?
Eason老歌迷
个人感觉,是不是你的pcr操作的问题
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问
qPCR设计的引物,序列完全相同,同一家公司订购,但是跑出来结果却是一个升高一个降低,这是什么原因哪?
Omiget12
可能有好多原因,体系的大小,操作手法,退火温度等等。
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问
为什么引物的3'端不能进行任何修饰,也不能有形成任何二级结构的可能,3'端碱基尽量不选用T?
迟C迟
因为引物的延伸是从3′端开始的,3′端不要终止于密码子的第3位,尽量不要用T,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
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问
qPCR实验重复性较差有什么原因导致?有没有可以的解决办法?
凌晨三点Dxy
1.人:操作不规范,每次实验存在较大人为误差,比如加样,加反应液等定量操作2.机:机器老化,电压电流或卤素灯不稳定(概率小)3.料:试剂耗材质量差,同批次参差不齐。(概率小)4.样:样本质量参差不齐,纯度、抑制物等原因
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问
求助 Collagenase A 是几型胶原酶?
府宅
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,是按照胶原酶消化的组织类型分类的,应该是属于单一成分。A、B、D、P、H型,是按照罗氏胶原酶产品分类的,应该是属于混合成分。
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问
求教,大片段目的基因(6700bp)如何获取?
府宅
可以根据数据库选择表达量高的部位进行模板制备,这样的话,也比较容易扩增出来;可以分成两三段就可以了,选择合适的酶切位点;再次,选择高保真的聚合酶,这样扩增出来不容易出现突变,可以适当提高循环数,增大产量,可以设置梯度PCR,寻找最优的条件。
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问
如果把不同个体的同一个基因的片段装在一块,那这个基因还能用吗?
迟C迟
最好不要用,不同个体同一个基因可能存在SNP,不同的基因序列在实验后期得到的结果将是不可信的。
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问
请问有什么办法可以扩GC含量高的片段吗?
迟C迟
可以购买生物公司专门的聚合酶,是专门对高GC含量的, 当扩增具有复杂的二级结构 (GC rich等) 的模板或具有重复序列的模板时,使用GC Buffer进行PCR扩增将非常有效。
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问
扩CDS区,前后大概各50bp左右没扩出来,请问这可以算把它的全长扩出来了吗?
迟C迟
肯定不能算CDS全长,几乎丢了100bp,就是30多个氨基酸,可能重要功能区都丢了,建议重新设计引物扩增。
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问
荧光定量pcr检测,每个样品需要做几次,为什么?
天一湖医者
最多一个样品一次,反应用两个重复,以防有明显的操作失误。如果两个孔的数据很接近,就取平均值作为一个值来看待。如果2者差别很大,说明有操作失误,这个样本的结果就不能要,需要重做。
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问
STR引物设计如何开始呢?
天一湖医者
引物以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3’末端与模板DNA一定要配对,但末端没有严格的限制,故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等;引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”;引物的终浓度一般为0.2~0.5μmol/L,过
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问
实时定量PCR进行比较时,需要进行统计吗?如何进行统计学分析?
秋秋欣欣
需要进行统计分析的,计算样本的平均±SD,CV
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问
pcr实验扩增曲线重复性不好怎么办呀~
迟C迟
1、引物特异性不好,扩增出多个目的条带会有波浪形扩增曲线。2、严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线,轻微的蒸发会是一种缓慢的上升,这些异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
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问
PCR扩增,扩增后进行1%电泳,没有条带
秋秋欣欣
那会不会是酶有问题呢,以及变温温度是否合适。
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问
qRT-PCR内参的选择问题
秋秋欣欣
CT值太小可以将样本稀释一下,另外其他两个内参变化大的话可以是其他原因,可以调整一下再看看
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