实时荧光定量PCR条件摸索

第一次接触实时荧光定量PCR实验，有一些问题想向各位老师请教

1.预实验：①计划在预实验时摸索（细胞接种量、药物刺激浓度）以及cDNA稀释倍数（1：2、 1：4、 1：8各设两个复孔）,引物特异性（看标准曲线、融解曲线、扩增曲线),延伸温度和延伸时间。不知道我计划摸索的条件是否均必要，或者预实验摸索条件主要是在哪些方面？大家一般都会设计两对不同的引物用于测试条件嘛？

2.对于同一细胞而言，检测不同基因表达，cDNA稀释倍数是否一致？还是每个基因检测时都需摸索对应的cDNA 稀释倍数？

3.正式 实验三次重复：我的想法是先培养同一代的三瓶细胞，三瓶细胞分别收集，然后接种于6孔板，每瓶细胞对应接种于对照组、C1组、C2组（各一个孔），之后每个孔所提的RNA反转为cDNA后，分为3个复孔上机检测。 不知道我这设计是不是相当于每组设置三个复孔，实验重复三次，或许有没有更好的设计方式，还请各位老师多多指教~