以质粒为模板的pcr克隆线性化载体pcr不出来怎么办

如题，质粒用的是从DH5α中提取出来的转化后的索来宝Pet-32a质粒。浓度为132ng/ml。现在想做同源重组，以质粒为模板做的载体线性化克隆pcr选取的酶切位点是ecor1和hind3。总共5900bp，用的vazyme p515 mix

50ul体系:

dd水 20.5ul

上下引物 （10um）2ul

质粒模板 0.5ul

mix 25ul

反应程序

预变性 95℃ 30s

变性 95℃ 15s

退火 58℃ 10s

延伸 72℃ 6min

彻底延伸 72℃ 5min

之后用dnp1 2ul37℃处理15分钟

有一次做温度梯度实验时10ul体系做的发现58℃有条带很暗但是单一正确。再做50ul体系进行胶回收发现一直扩增不出来结果如图所示。也不知道是什么原因。已经p了2个星期了。。。