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        毕赤酵母高效转化实验方案

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        毕赤酵母高效转化实验方案
        1.收集菌体
        取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中,4℃、10000g 离心1min,弃上清,沉淀用无菌水(4℃)洗涤,同样条件下离心,弃上清。
        2.菌体处理
        加入1ml处理液,室温下放置20min。
        处理液:
        10mM LiAc
        10mM DTT
        0.6M sorbitol
        10mM TrisHCl(pH7.5)
        3.离心,弃上清,加入1ml 1M sorbitol ,离心,弃上清,
        4.用1M sorbitol洗涤二次,到最终体积约为80μl.(菌体太多可适当弃去部分)
        5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒,混匀后转入 电击杯中,冰浴5min.
        6.电转. 1.5kv,25μF,200Ω条件下进行电转。
        7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol,吸出后于30℃培养2h。
        8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin,涂布的量分别为100、200微升,剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)

        有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。

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