碱性阳离子酵母转化试剂盒

碱性阳离子酵母转化试剂盒

Alkali-Cation Yeast Transformation Kit

 

一、 产品描述：

碱性阳离子酵母转化试剂盒提供了一种有效的酵母转化方法，可以以一种简单快速，而且是非电转的方式，将线性 DNA 或质粒 DNA 转化到酵母中。宿主细胞通过 醋酸锂/醋酸铯混合物处理成为感受态细胞，方便进行转化。整个过程可以在 90 分钟内完成，而通常可以实现 10⁴ 转化子/μg DNA 以上的转化效率。Alkali-Cation Yeast Transformation Kit 也已成功运用在毕赤酵母中将线性 DNA 转化，进行蛋白质表达研究。

Alkali-Cation Yeast Transformation Kit 使用方便，效果可靠，并且可以根据样品量调节用量，使得此试剂盒成为酵母双杂交实验的不错选择

二、 产品特点:

 简单快速的酵母 DNA 转化试剂盒

 非电转，不需要电转设备

 包含了酵母转化所需的全部试剂

 整个过程可以在 90 分钟内完成

 转化效率高，≥104 转化子/μg 质粒 DNA

三、 组份：

四、 使用前注意事项：

1. 如果顶层琼脂用于培养转化酵母，除了浓度应为平板琼脂的一半外，其他应该与平板琼脂相同。其温度不能超过 50℃。

2. 试剂盒应储存在 4℃的环境中。

五、 快速操作指南：

六、 实验步骤：

1. 在 100 ml YPD（YEPD）培养基（MP Biomedicals Cat#. 4001-021）中接种 1 个单克隆菌落，在通风的 30℃培养环境下培养至对数中期，达到约 2x10⁶ - 2x10⁷ 菌体/ml（大概需要 12-24 小时）。

2. 400 x g 离心 5 分钟，沉淀菌体，去掉上清。

3. 用 9 ml pH 7.5 的 TE buffer 重悬细胞。离心沉淀菌体，去除上清。

4. 用 5 ml 醋酸锂/醋酸铯溶液轻柔地重悬细胞。

5. 在轻柔摇动的情况下，在 30℃孵育 30 分钟。发生的反应：醋酸锂/醋酸铯溶液使酵母细胞膜通透性增加，成为感受态状态。

6. 400 x g 离心 5 分钟，沉淀菌体，去掉上清。

7. 用 1 ml pH 7.5 的 TE buffer 轻柔地重悬细胞。细胞此时可用于转化。

8. 在一个 1.5 ml EP 管中加入：

 100 μl 酵母细胞

 5 μl Carrier DNA

 5 μl Histamine Solution

 10 μl 质粒 DNA，含有 0.01-1.0μg 质粒

轻柔混匀，室温孵育 15 分钟。

9. 在另一个管中，为每个反应加入 0.8 ml PEG 和 0.2 ml TE/Cation MIXX 并混匀，然后在每个转化反应中加入 1 ml 该混合液。用移液器轻轻吸打混匀细胞。

10. 在 30℃孵育 10 分钟。发生的反应：让 DNA 附着到酵母细胞表面。

11. 42℃热激 10 分钟，冷却到 30℃。发生的反应：热激让酵母细胞壁通透性增大，DNA 可以进入细胞。

12. 14,000 x g 离心 5-10s 沉淀菌体，去除上清。

13. 用 200μl SOS buffer 重悬菌体，直接涂布到合适的选择性培养平板或者上层琼脂上。在 30℃培养 48-72h，直到转化的克隆长出。

七、 常见问题解答：

1. 问题：PEG 在转化过程中的作用？

回答：PEG 可以在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜，减少醋酸锂对细胞膜结构的过度

损伤，同时使质粒与细胞膜接触更紧密，促进转化。

2. 问题：Carrier DNA 在转化过程中的作用？

回答：酵母细胞中含有 DNA 酶，能够降解外源 DNA，因此在转化过程中我们要用到“替罪羊”carrier DNA，其为短的线形单链 DNA，在转化实验中主要是保护质粒免于被 DNA酶降解；另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒 DNA 中发挥协助作用。

3. 问题：酿酒酵母表达系统特点？

回答：

优点：

（1）酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素；

（2）安全性好，已被美国 FDA 认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验；

（3）酿酒酵母是真核生物，可以对蛋白进行翻译后加工；

（4）表达产物可分泌表达，易于纯化；

（5）酿酒酵母生长迅速、工艺简单、成本低；（6）遗传背景清楚，易进行操作。

不足：

（1）对真核基因产物的翻译后加工与高等真核生物有所不同，重组蛋白常发生超糖基化，每个 N 一糖基链上都含 10 0 个以上的甘露糖，是正常的十几倍；

（2）酿酒酵母不易进行高密度发酵，表达产物产量低；

（3）该表达系统质粒易丢失，传代不稳定；

（4）分泌效率低，> 30 kD 的蛋白质几乎不分泌。

4. 问题：毕赤酵母表达系统优点？

回答：毕赤酵母 Pichia pastoris 目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。在医药蛋白领域，已有胰岛素、乙肝表面抗原、人血清白蛋白、表皮生长因子等多种蛋白使用毕赤酵母表达实现商品化制备。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产

（1）具有目前已知最强的启动子—AOX 启动子；

（2）可进行高密度培养，利于工业化生产；

（3）产物既可胞内表达又可分泌表达，易于纯化；

（4）产物表达量高，最高可达十几克/ 升；

（5）整合型表达，菌株遗传稳定；

（6）与酿酒酵母相比，产物糖基化程度低，糖基化位点为 Asn-X-Ser/Thr，与哺乳类细胞相同适合医用。

5. 问题：酿酒酵母表达系统与毕赤酵母表达系统的差异？

回答：

酿酒酵母具有一定的翻译后加工能力和糖基化修饰，但是不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，一般超糖基化；产物蛋白质不均一，信号肽加工不完全，内部降解，多聚体形成等。表达外源蛋白占菌体总蛋白的 10%，分泌表达时分泌效率相比较低。 毕赤酵母表达产物具有适当糖基化，进行高甘露糖型糖基化，与哺乳动物不同。且表达的产物具有脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。但是分泌表达的蛋白在培养中可以被自身分泌的蛋白酶降解。表达外源蛋白约占菌体总蛋白的 30%，表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。

九、 部分参考文献：

1. Li, L., & Blankenstein, T. (2013). Generation of transgenic mice with megabase-sized human yeast artificial chromosomes by yeast spheroplast–embryonic stem cell fusion. Nature Protocols, 8(8), 1567–1582. doi:10.1038/nprot.2013.093

2. Stephen R. Hughes, Elby J. Cox, et al., Process for Assembly and Transformation into Saccharomyces cerevisiae of a Synthetic Yeast Artificial Chromosome Containing a Multigene Cassette to Express Enzymes That Enhance Xylose Utilization Designed for an Automated Platform, Journal of Laboratory Automation 2015, Vol. 20(6) 621 –635

3. Mehrabi, R., Ding, S., & Xu, J.-R. (2008). MADS-Box Transcription Factor Mig1 Is Required for Infectious Growth inMagnaporthe grisea. Eukaryotic Cell, 7(5), 791–799. doi:10.1128/ec.00009-08

4. Costa, C., Ribeiro, J., Miranda, I. M., et al., (2016). Clotrimazole Drug Resistance in Candida glabrata Clinical Isolates Correlates with Increased Expression of the Drug:H+ Antiporters CgAqr1, CgTpo1_1, CgTpo3, and CgQdr2. Frontiers in 

Microbiology, 7. doi:10.3389/fmicb.2016.00526

5. Hughes, S. R., Cox, E. J., Bang, S. S., et al., (2015). Process for Assembly and Transformation into Saccharomyces cerevisiae of a Synthetic Yeast Artificial Chromosome Containing a Multigene Cassette to Express Enzymes That Enhance Xylose Utilization Designed for an Automated Platform. Journal of Laboratory Automation, 20(6), 621–635. doi:10.1177/2211068215573188

6. Kim, H., Lee, H.-S., Park, H., Lee, D.-H., et al., (2017). Enhanced production of xylitol from xylose by expression of Bacillus subtilis arabinose:H + symporter and Scheffersomyces stipitis xylose reductase in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 107, 7–14.

7. Liu, W., Zhou, X., Li, G., Li, L., Kong, L., Wang, C., … Xu, J.-R. (2011). Multiple Plant Surface Signals are Sensed by Different Mechanisms in the Rice Blast Fungus for Appressorium Formation. PLoS Pathogens, 7(1), e1001261.

8. Li, G., Zhou, X., Kong, L., Wang, Y., et al., MoSfl1 Is Important for Virulence and Heat Tolerance in Magnaporthe oryzae. PLoS ONE, 6(5), e19951.

9. Su, M.-Y., Peng, W.-H., Ho, M.-R., et al., (2015). Structure of yeast Ape1 and its role in autophagic vesicle formation. Autophagy, 11(9), 1580–1593.