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        技术和方案1 酵母的高效转化

        相关实验：酵母遗传学方法实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        该方法摘自 Gietz 和 Schiestl (1995)。 1 ) 接种5;〇 11液体¥?八0或1〇 11113(3,30< €下振荡培养过夜。 2 ) 计数过夜培养物细胞密度，以最终5X 106个/m l的细胞密度接种至50ml YPAD培养液。 3 ) 置 30°C ， 200 r/min振荡培养至2X 107个/ml，这通常需要3〜5h，该培养物的细胞 足够供10次转化用。 注意： （1 ) 重要的是让细胞至少完成两次分裂； ( 2 ) 在细胞的3 或 4 次分裂期间，转化效率恒定。 4 ) 用 50m l无菌离心管以3000g (2500r/min) 离 心 5m in，收集细胞。 5 ) 弃培养液，把细胞重悬在25m l无菌水中，再同上离心。 6 ) 弃水，把细胞悬浮在lm l的 100mm〇l/L 乙 酸 锂 （ U Ac) 中，转悬浮物到一个无菌 1.5m l离心管。 7 ) 高速离心5s 沉淀细胞，用微量移液器吸尽乙酸锂。 8 ) 悬浮细胞到最终5(%1体积（2X 109个/ml)，其中，大约含4(%丨的100mmol/L乙酸锂。 注意： 如果培养物的细胞数量大于2X 107个/ml，将增加乙酸锂的体积以维持2X 109 个/m l的悬浮细胞量。如果培养物的细胞量低于2X 107个/ml，则应减少乙酸锂量。 9 ) 将 lm lssD N A (担体）样品煮沸5mm，快速在冰水中冷却。 注意： 没必要每次都煮ssDNA，放置小等份在冰盒里，冻 融 3 或 4 次后，需再煮 沸 ，取出后应放置在冰上。 1 0 ) 振荡细胞悬浮液，取 50^1样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量移液 器除去乙酸锂。 1 1 ) 基 本 “转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序加人： 240^1 PEG (50% m/V ) 36jul 1. Omol/L 乙酸锂 25jul ssDNA (2. Omg/ml) 50^1 水和质粒 DNA (0.1〜lOjug) 注意： 按顺序加入是很重要的。应考虑最先加人PEG可保护细胞免受高浓度乙酸 锂的不利影响。 1 2 ) 剧烈振荡每个反应管直到细胞完全混勻，通常需要lm in 左右。 1 3 ) 置 30°C保温 30min。 1 4 ) 置 42°C水浴中热激20〜25mm〇 注意： 最适热激时间随不同酵母而异。如果需要获得高转化频率，需事先测试最佳 时间。
        1 5 ) 以 6000〜8000r/min的速度离心15s，用微量移液器除去转化混合液。 1 6 ) 吸 0. 2〜1. 0m l无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。 注意： 如果想获得高转化频率，这一步需尽可能温和地操作。 1 7 ) 用等份的2 0 0 4 转化混合液涂选择平板。 材料和溶液 聚 乙 二 醇 （ PEG， 50% m/V ) (相对分子质量 3350, Sigma P3640) 加水至终浓度5 0 % (m/V )，用 0.45|um 滤 膜 （ Nalgene) 进行过滤除菌。也可将 PEG溶液进行高压灭菌，但一定要小心确保PEG溶液处于适当的浓度。此外，重要的 是 将 PEG溶液保存于密封容器中，以防水分蒸发导致溶液浓度升高，在转化反应中， 只要稍微改变最适浓度（3 3 % ) ，就会减少转化子数。 ssDNA (2mg/m l) 高相对分子质量DNA (来自沙门氏试验中DI型脱氧核酸钠盐，Sigma D1626) T E 缓 冲 液 （ pH8.0) 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) 1. Ommol/L EDTA 1 ) 称 200mgDNA溶 于 lOOmlTE缓冲液中。用 10m l移液管反复上下抽动使DNA分 散均匀，然后置于磁力搅拌器中剧烈搅拌2〜3h 直到完全溶解，或将溶液密封，置 冷库内搅拌过夜。 2 ) 分装DNA样 品 （ 每 份 10(^1较适宜），置一20°C条件下保存。 3 ) 使用前，每 份 D N A 样品放沸水浴中至少5min，之后置于冰浴中快速冷却。 提 示 1) ssDNA煮沸后，冷冻，重复使用3 或 4 次。如果用煮过的ssDNA, 转化效率开始下 降时，那么就要重新煮，或用另一份新DNA样品。 2 ) 在该方法中用较低浓度（2mg/m l) 的载体D N A 较为适宜，重复性也较好。 3 ) 在早期的方法中，用苯酚/氯仿抽提可确保最大的转化效率。如果所用DNA的质量 好 ，就没必要抽提，可事先测试一下DNA载体的质量以便决定是否需要进行抽提。 1. Omol/L 乙 酸 锂 （ LiAc) 母液 用去离子水配制l .Omol/L 母液，过滤除菌，此溶液无需进行标定，但最终p H 应 在 8. 4〜8. 9。

        来源：丁香实验

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