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        高效转化法

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 取 10 μl 细胞在 YPAD 平板上涂布 2 cm2,培养过夜;或者接种 5 ml 的 YPAD 液体培养基,于 30℃ 震荡培养过夜。

        2. 将一瓶 YPAD 培养基于 30℃ 平衡过夜。

        3. 去 50 ml YPAD 培养基加到一个灭菌的 250 ml 的培养瓶中,接种一接种环来源于平板的细胞或 5 ml 液体培养基,混匀,测定 5 倍稀释后的光密度。

        4. 于 30℃ 以 200 r/min 振荡培养,至 10 倍稀释后 OD600 为 0.2,相当于 2X107 个细胞/ml,需要 3.0~4.5 个小时。该培养物可用于 10 次转化。

        5. 用一个灭菌的 50 ml 离心管收获培养物,3000 g 离心 5 分钟。

        6. 倒掉培养基,用 20 ml 灭菌水重悬细胞,再次离心。

        7. 倒掉水,用 1.0 ml 100 mmol/L 的 LiAc 重悬细胞,并转移到一个 1.5 ml 的微量离心管中。

        8. 用微量离心机以最高转速离心 15 秒,用微量加样器吸出 LiAc。

        9. 用 100 mmol/L 的 LiAc 重悬细胞,使终体积为 500 μl,于 30℃ 孵育 15 分钟。

        10. 将 1.0 ml 的 ssDNA 样品煮沸 10 分钟,于冰水中迅速冷却。

        11. 基本的转化混合物包括 240 μl 的 PEG、25 μl ssDNA、5.0 μl 质粒 DNA 和 45 μl 水。

        12. 涡旋混匀细胞悬液,取 50 μl 加到标记的微量离心管中,离心用微量加样器除去 LiAc。

        13. 向细胞沉淀中加入 350 μl 转化混合物,剧烈涡旋以重悬细胞。

        14. 30℃ 水浴孵育 30 分钟。

        15. 42℃ 水浴热休克 20 分钟。

        16. 用微量离心机最高速度离心 15 秒,去掉转化混合物。

        17. 每管加 1.0 ml 水,通过吹打和剧烈涡旋以重悬沉淀。

        18. 取 10 μl 悬液稀释到 1.0 ml 灭菌水中,涂 100 μl 该稀释液到 2 到 3 块相应 SC 减样选择培养基平板上。

        19. 将该 SC 减样选择培养基平板孵育 2~4 天,以获得转化子。




        来源:丁香实验

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