质粒

woshizhixiaofei 如题，谢谢大家song333 cut the part containing the plasmid, put in water (small volume if possible), then transformation using the water (containing plasmid).fengye_liu cut the part containing the plasmid, put in water (small volume if possible), then transformation using ...

lope 请教各位大侠：购买的UPSTATE的TOPFLASH/FOPFLASH质粒，准备做双荧光素酶报告基因检测，看文献上都只是用这个质粒和Renilla的载体共转染细胞，是否这个质粒本身就携带了Firefly萤光素酶呢？我看了说明书，只是说two full and one incomplete copy of the TCF binding site (mutated) followed by three copies in the reverse orientation, upst ...

穿越之后叫小丫 新构建的质粒抽提后跑PCR能跑出我的目的条带，但是酶切验证时却没有我要的片段，我把扩增目的片段的引物和原始质粒做了比对并没有互补序列啊，这是什么情况呢？电泳图在附件中，请各位大侠帮忙解解惑啊！谢谢！济南基美 可能是引物中污染了模板或者是酶切不成功ylong12 看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了穿越之后叫小丫 济南基美 wrote:可能是引物中污染了模板或者是酶切不成 ...

liuruya 问别人要了个带GFP-tag（GFP-N2载体）的质粒，目的基因1.4kb，分子量约52kD，转染293T细胞能见荧光，WB杂不出来，设置了阴性和阳性对照证实不是WB的技术问题。后来又换了个flag-tag，仍然杂不出来WB。仔细检查过序列，不存在移码的问题，非常费解。有同学分析是空间位阻问题，不知换个tag是不是能解决这个问题。有同学遇到过这种问题么，或者帮忙分析一下可能的原因。谢谢！！！zhuqueleee ...

dengjie19841217 大家能不能帮我看看这张质粒双酶切的电泳图，上方边缘怎么会这么毛糙，本来是要切胶纯化后作插入目的片段的，怕会影响后面的连接，所以没纯化！已经出现两次同样的状况了，之前做的时候都还是很干净的一条带，不知道是怎么回事啊！载体是pGL3-Basic，酶切位点Mlu I和Xho I，酶切2小时后，1%琼脂糖凝胶电泳，80v电压45min。大家快来帮帮我吧falan87 我最近也在做双酶切连接，做了好几次都出 ...

zhangyuxianggx 各位大侠好！现有pcDNA3-mCherry和pGEM-hgene两个东西在滤纸上，老师就说让构建载体，具体是什么意思啊？我理解的是一个真核表达载体和构建好的pGEM质粒，但是不知下一步该怎么做？恳请各位好心的大侠指点一二。shylook 直接插入cDNA吧zhangyuxianggx 那个pGEM就是已经插入了DNA的载体。请问这两个东西溶下来以后要怎么保存zjubell 剪下来。TE融解，再 ...

wangch84 各位高手，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000 bp的片段，通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：1. 通过LA Taq酶扩增，并纯化回收目的片段（引物中带有酶切位点，保护性碱基＝3，上游带有Kozak序列）；由于回收效率很高，所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段，H2O 20 μl，10 X K BUFFER 4 μl，两种酶各2 μl，37℃作用过夜（12-14 h），再进行胶回收。2. 载体pc ...

指葫芦 我是一个初学者，要大量提质粒。发现实验室的离心机最高为4300rpm，可是说明书上要求13000rpm。想请问各位达不到说明书上的要求可以吗？再者，提质粒的时候不是都要低温吗？为什么说明书上说的是常温离心？望请大家帮忙帮忙，再此不甚感激！shylook 你用天根这样的kit做大抽的话因为不是考离心沉降质粒所以 我想 速度影响不大 你试试其他kit 4300rpm的话 你延长一倍时间也应该可以wwjsix 最好按照说明书来说。质粒抽 ...

lixingliang1987 本人最近小提质粒，挑取单克隆于3毫升LB培养基培养6小时候抽质粒，发现浓度只有50纳克每微升。后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时，收集10ml菌液进行离心，裂解，上柱（10ml菌液只上一个柱子，量绝对足够了吧），结果浓度才300纳克每微升，我本计划下步做转染，如此低得浓度我很是担心啊不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒，是高拷贝的。PS：我怀疑是不 ...

zjf0709 左侧的是提取的PUC18质粒，中间的marker不太好（可以忽略），右侧的marker是DL2000，由于跑得时间过长所以marker跑散了，右侧DL2000最上面的一个条带是2000bp，PUC18的序列是2686bp，为什么会跑的比2000bp还快？这个现象正常吗？是不是超螺旋的问题？请大家帮忙解答，谢谢！！！zjf0709 自己顶一下，请大家帮忙看一看。济南基美 是超螺旋的质粒，所以跑的快。一条带，说明都是 ...

whm5869 我构建了一个质粒，包括目的基因片段和一小段启动子，测序结果完全正确，我们实验室的工作人员说理论上应该表达但是我转染细胞做WESTERN鉴定，就是不表达，请问这是为什么啊，谢谢各位大侠了whm5869 我用的是polyjet转染试剂，操作等基本没问题，谢谢大家了pharmaceutic 以前我站构建质粒的时候也遇到过这种问题，最后换了一个载体以后就表达了。最后分析认为不同的基因可能有启动子喜好，一般情况下 ...

shinesnowing 想构建一个能通过接合作用进入野生型弧菌并在其中表达外源基因的质粒，现在找到一个名为pBOR8的质粒，只有质粒简图，没找到全序列，质粒上的元件为ori R6K、mob RP4、Ap、lacIq，如下图:现有两个问题想请教各位高人（1）该质粒能否直接作为表达载体，将外源基因克隆到该质粒上，如果可以通常外源基因应该克隆到哪个位点？（2）如果不能直接进行外源基因克隆和表达，那么应该如何进行改造？烦请各位不吝赐 ...

443201299 吉玛的shRNA质粒怎么样??吉玛的shRNA质粒最便宜，但不知道它的质量如何，有谁用过吗？感觉质量怎么样？西厢蔷薇 买过几次，一般吧。443201299 下调效率怎么样？？shylook 还是不错的443201299 吉玛的shRNA质粒载体好像是最便宜的！西厢蔷薇 我那个基因本来就是抗外源基因的，所以下调的比较差，买了两次，有一个下调了25%左右华因康基因公司 吉玛的东西一般吧epdn 广州锐博的也不贵噢。akachan ...

wj1989113 最近一直在做慢病毒载体，用的是第二代的三质粒系统，目的片段是一个肝细胞的转录因子。载体构建好之后，包装了一批病毒。然后拿慢病毒感染肝癌细胞株3B和Huh7细胞，想通过PCR和Western验证病毒的表达情况。出现了一些问题：1、每次拿慢病毒感染肝癌细胞株，荧光都很亮，但是做PCR或者Western之后，加对照病毒GFP组的细胞和目的病毒无差异。（条带都较亮）尤其是Western，几乎没有差异。2、感 ...

dlh110 我构建了个microRNA的带GFP标签的质粒，不知道能不能与目的基因的3’UTR luciferase报告载体共转来检测luciferase的活性？bigbang_0_0 这个实验还要谨慎考虑一下，GFP的绿色荧光可能会干扰luciferase检测结果。另外你说的microRNA带GFP标签，你要保证两个东西都要有表达且保持活性，建议你最好把这两个东西构建成两个转录单位，由两个启动子分别起始两个东西的转 ...

douermm 最近需要扩增质粒，RNAi用的。接大肠杆菌种用的LB培养基，看有的文章上写的配成PH=7.0的，有的写配成PH=7.5的，到底应该配成多少呢？还有，用买的比如麦康凯培养基，会不会比自己配的效果好？谢谢~！slytjiaofei ph7或7.5对大肠杆菌生长基本没有任何影响。douermm 谢谢楼上~本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：sh ...

lf2003128245 本人手上有个慢病毒的质粒，目的基因是通过SalI酶切位点插入的，我想将这个基因切下来重新构建，希望有经验的大侠能够指点，可以选择些什么样的质粒呀，最好是带有GFP标记的非病毒质粒，还有个问题请教就是，病毒载体是不是不需要类似于G418筛选的标记呀？如果我找到个质粒，将这个基因连上去之后，怎么才能鉴别/筛选目的基因正反向的问题？谢谢了！fjxie 目的基因是通过SalI酶切位点插入的，我想将这个 ...

2012hunanjob 在xbaI酶切位点上：T^CTAGA碱基对应的是AGATC^T，因为质粒是双链，所以在质粒的xbaI酶切位点上中间肯定有GATC，所以说：我觉得理论上只要是dam+细菌提出来的质粒，xbaI酶切位点都受甲基化影响而切不开.但是我见过别人也是用dam+菌扩增过质粒，用xbaI也可以切开它的酶切位点~~~所以我就迷糊了，请各位大侠们多多指点，小弟在此感激不尽了~~~2012hunanjob 顶，有没有人 ...

2012hunanjob 在xbaI酶切位点上：T^CTAGA碱基对应的是AGATC^T，因为质粒是双链，所以在质粒的xbaI酶切位点上中间肯定有GATC，所以说：我觉得理论上只要是dam+细菌提出来的质粒，xbaI酶切位点都受甲基化影响而切不开.但是我见过别人也是用dam+菌扩增过质粒，用xbaI也可以切开它的酶切位点~~~所以我就迷糊了，请各位大侠们多多指点，小弟在此感激不尽了~~~2012hunanjob 顶，有没有人 ...

bobbymm 我在做hBrf1这个基因，目前是要构建4个质粒。步骤：1、PCR引物设计，加酶切位点，扩增产物2982+56bp，跑胶鉴定。2、PCR产物跑胶，回收，phenol,chloroform,NaAc+Ethanol提纯。老板说如果测浓度太浪费sample3、双酶切，体系100ul,两个酶分别为2ul。双酶切之后提纯。（已经双酶切PGL3-basic，酶切过的在LB平板上长出3个克隆，没有酶切过的载体则是一片一片的 ...