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        【求助】请教关于xbaI酶切位点甲基化的问题(看了这么多帖子,都好象没分析到位啊)

        丁香园论坛

        7619
        在xbaI酶切位点上:T^CTAGA碱基对应的是AGATC^T,因为质粒是双链,所以在质粒的xbaI酶切位点上中间肯定有GATC,所以说:我觉得理论上只要是dam+细菌提出来的质粒,xbaI酶切位点都受甲基化影响而切不开.但是我见过别人也是用dam+菌扩增过质粒,用xbaI也可以切开它的酶切位点~~~所以我就迷糊了,请各位大侠们多多指点,小弟在此感激不尽了~~~
        顶,有没有人知道啊,急啊,谢谢大家了啊,谢谢
        可能把dam(斜体)的标记当作是dam-containing了
        bigbang_0_0 wrote:
        Xba1对哺乳动物的CpG甲基化敏感,对大肠杆菌的dam,dcm甲基化不敏感,详见产品说明书


        谢谢这位好心人的回复,但是这个不是xbaI的特点吧~~~~继续顶,求助
        我的意思是不是没说清楚啊,呵呵,不好意思啊

        我的意思是在xbaI酶切位点上,双链中的其中一条链肯定是 AGATC^T ,这个酶切位点中间本身就有dam甲基化的识别序列,所以只要是dam+细菌提出来的质粒,xbaI酶切位点都受甲基化影响而切不开,但实际并非如此,请大家指教啊!!!!!
        就一点,是从5到3读链的,认为的酶切位点甲基化,是因为你的读的是互补链,;你的方向反了,所以当然是可以切开的
        很抱歉鄙人先前没读懂你的问题,请见谅!

        楼上哥们儿正解,我再补充一下:

        1、切开切不开与flanking seq有关,如果质粒上该酶切位点左边不是GA且右边不是TC,那么Xba1还是可以将其切割的;

        2、你确定那个人切的是质粒而不是已经被包装好的噬菌粒吗?大约有50%的噬菌体DNA合成后,来不及被dam甲基化就已经被包装到衣壳中了;

        3、那个人用的Xba1内切酶被别的酶污染了;

        不知道还有其它哪些种可能性,反正知道的我都show了,望楼主满意!
        bigbang_0_0 wrote:
        很抱歉鄙人先前没读懂你的问题,请见谅!

        楼上哥们儿正解,我再补充一下:

        1、切开切不开与flanking seq有关,如果质粒上该酶切位点左边不是GA且右边不是TC,那么Xba1还是可以将其切割的;

        2、你确定那个人切的是质粒而不是已经被包装好的噬菌粒吗?大约有50%的噬菌体DNA合成后,来不及被dam甲基化就已经被包装到衣壳中了;

        3、那个人用的Xba1内切酶被别的酶污染了;

        不知道还有其它哪些种可能性,反正知道的我都show了,望楼主满意!


        谢谢bigbang_0_0给我的回答,我现在明白了,我犯了个低级错误,这个阅读的方向性被我忽略了。自我检讨一下,呵呵,再次表示对您的回答的感谢~~~~
        我今天用了takara的

        E.coli Competent Cells HST04 dam-/dcm-
        感受态细菌,但是酶切还是没有成功,我不知道为什么了,请大家支招,在下谢过了先
        顶顶顶

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        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】请教关于xbaI酶切位点甲基化的问题(看了这么多帖子,都好象没分析到位啊)

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