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        【求助】质粒构建中的疑惑

        丁香园论坛

        1944
        新构建的质粒抽提后跑PCR能跑出我的目的条带,但是酶切验证时却没有我要的片段,我把扩增目的片段的引物和原始质粒做了比对并没有互补序列啊,这是什么情况呢?
        电泳图在附件中,请各位大侠帮忙解解惑啊!谢谢!
        可能是引物中污染了模板
        或者是酶切不成功
        看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了
        济南基美 wrote:
        可能是引物中污染了模板
        或者是酶切不成功
        引物是新鲜溶解的,而且在配反应体系时我最先加的就是引物,怎么也沾不到模板啊,这个可以排除。酶切的话,电泳图上酶切后质粒的条带都比酶切前跑得慢,这应该证明是切开了的吧
        ylong12 wrote:
        看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了
        4个质粒用的相同的酶,相同的时间1小时,3号质粒就切开了,其他质粒就产生星活性切不开了?而且酶切后质粒的条带明显比酶切前跑得慢,符合超螺旋>线性>半开环的泳动速度啊,说明是切开了的。难道是切成半开环的了?不明白啊不明白
        穿越之后叫小丫 wrote:
        引物是新鲜溶解的,而且在配反应体系时我最先加的就是引物,怎么也沾不到模板啊,这个可以排除。酶切的话,电泳图上酶切后质粒的条带都比酶切前跑得慢,这应该证明是切开了的吧

        那可能是一个酶切开了,你有没有空载体的酶切对照?一样大吗?
        只有3号是阳性的!

        PCR有污染了,换一对引物,做个阴性对照再扩增一次吧
        我之前构建过超表达载体,用自己引物设计时所带的酶进行双酶切也是切不开或者就是切的片段大小不对,后分析原因导师说是甲基化了,切不开的是阴性,我又载体多克隆位点上找了一对另外的酶阳性就切开了。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

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        【求助】质粒构建中的疑惑

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