【求助】质粒构建中的疑惑
丁香园论坛
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新构建的质粒抽提后跑PCR能跑出我的目的条带，但是酶切验证时却没有我要的片段，我把扩增目的片段的引物和原始质粒做了比对并没有互补序列啊，这是什么情况呢？
电泳图在附件中，请各位大侠帮忙解解惑啊！谢谢！
电泳图在附件中，请各位大侠帮忙解解惑啊！谢谢！
可能是引物中污染了模板
或者是酶切不成功
或者是酶切不成功
看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了
济南基美 wrote:
可能是引物中污染了模板
或者是酶切不成功
ylong12 wrote:
看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了
穿越之后叫小丫 wrote:
引物是新鲜溶解的，而且在配反应体系时我最先加的就是引物，怎么也沾不到模板啊，这个可以排除。酶切的话，电泳图上酶切后质粒的条带都比酶切前跑得慢，这应该证明是切开了的吧
那可能是一个酶切开了，你有没有空载体的酶切对照？一样大吗？
我之前构建过超表达载体，用自己引物设计时所带的酶进行双酶切也是切不开或者就是切的片段大小不对，后分析原因导师说是甲基化了，切不开的是阴性，我又载体多克隆位点上找了一对另外的酶阳性就切开了。
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