【求助】求可以用Sal酶切位点重新构建的质粒
丁香园论坛
1730
本人手上有个慢病毒的质粒，目的基因是通过SalI酶切位点插入的，我想将这个基因切下来重新构建，希望有经验的大侠能够指点，可以选择些什么样的质粒呀，最好是带有GFP标记的非病毒质粒，还有个问题请教就是，病毒载体是不是不需要类似于G418筛选的标记呀？如果我找到个质粒，将这个基因连上去之后，怎么才能鉴别/筛选目的基因正反向的问题？谢谢了！
目的基因是通过SalI酶切位点插入的，我想将这个基因切下来重新构建，希望有经验的大侠能够指点，可以选择些什么样的质粒呀? pcDNA 3.1 就可以了。
最好是带有GFP标记的非病毒质粒， 有的pcDNA3.1有带GFP标记的。
还有个问题请教就是，病毒载体是不是不需要类似于G418筛选的标记呀？
看你实验目的，一般来说，G418是耐药筛选转染后的细胞株，将没转染成功的细胞用G418杀死，但如果只是做基因治疗的话，基因的转染成果与否，感染细胞的效果可以用流式细胞或荧光显微镜看GFP的表达就可以了。
如果我找到个质粒，将这个基因连上去之后，怎么才能鉴别/筛选目的基因正反向的问题
你可以根据质粒图谱看，定向将启动子CMV后 将基因定向克隆进去，利用酶切反应及连接的特异性。
ps： 感觉你对自己的实验目的都不是很清楚，这很危险！宁可不做，就怕费力不讨好！
最好是带有GFP标记的非病毒质粒， 有的pcDNA3.1有带GFP标记的。
还有个问题请教就是，病毒载体是不是不需要类似于G418筛选的标记呀？
看你实验目的，一般来说，G418是耐药筛选转染后的细胞株，将没转染成功的细胞用G418杀死，但如果只是做基因治疗的话，基因的转染成果与否，感染细胞的效果可以用流式细胞或荧光显微镜看GFP的表达就可以了。
如果我找到个质粒，将这个基因连上去之后，怎么才能鉴别/筛选目的基因正反向的问题
你可以根据质粒图谱看，定向将启动子CMV后 将基因定向克隆进去，利用酶切反应及连接的特异性。
ps： 感觉你对自己的实验目的都不是很清楚，这很危险！宁可不做，就怕费力不讨好！
用pEGFP质粒，很适合GFP标签的蛋白的表达；
如果做稳定转染，需要用G418筛选标记 (neo r)
判断连接方向，可以通过两种方法：1、PCR，两条引物中一条是载体上的通用引物，另一条是扩增目的片段时用的引物
2、酶切，使用SalI酶和目的片段中的一个酶切位点做双酶切，根据条带大小判断插入方向。
如果做稳定转染，需要用G418筛选标记 (neo r)
判断连接方向，可以通过两种方法：1、PCR，两条引物中一条是载体上的通用引物，另一条是扩增目的片段时用的引物
2、酶切，使用SalI酶和目的片段中的一个酶切位点做双酶切，根据条带大小判断插入方向。
谢谢！我也是准备用pEGFP质粒来做，请问你有这个质粒的序列吗？我在网上没有找到。
也要谢谢上面的那位大侠，可能是我表述的不清楚，把几个问题搞在一起了，让你没明白我的意思，谢谢
测序能解决你insert位置的问题 而且也是必须的
慢病毒质粒问题 你应该google下
普通质粒的话 带荧光的话 有pEGFP pIRES2-EGFP这样的融合和非融合的过表达质粒
考虑你的需要选择什么质粒
慢病毒质粒问题 你应该google下
普通质粒的话 带荧光的话 有pEGFP pIRES2-EGFP这样的融合和非融合的过表达质粒
考虑你的需要选择什么质粒
我这有pEGFP-N1的序列
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
