质粒测序正常，WB杂不出来，是什么原因？

问别人要了个带GFP-tag（GFP-N2载体）的质粒，目的基因1.4kb，分子量约52kD，转染293T细胞能见荧光，WB杂不出来，设置了阴性和阳性对照证实不是WB的技术问题。后来又换了个flag-tag，仍然杂不出来WB。仔细检查过序列，不存在移码的问题，非常费解。有同学分析是空间位阻问题，不知换个tag是不是能解决这个问题。有同学遇到过这种问题么，或者帮忙分析一下可能的原因。谢谢！！！

1，酶切或者测序鉴定下目的基因是不是完整
2，WB也不是万能的，如果你只是看表达情况的话，WB做不出来可以换用其他方法，比如RT-PCR，免疫荧光等
3，换个TAG是个办法，但是也要先确定目的基因是不是完整

检查抗体的效价和特异性，以及转膜成功与否。

你是用gfp抗体和flag抗体做的western还是用目的蛋白的抗体做的western，如果是目的蛋白抗体做的western没做出来，可能两个原因，第一个是抗体不好，第二个可能是质粒没做好，发生移码了，因为你用的是pEGFP-N2载体，gfp是在n端，就算发生了移码一样可以检测到绿色萤光，仔细检查下你做的质粒看看是否正确。

谢谢大家的回复
1.WB应该是没有技术问题，用的是GFP或flag的标签抗体，而且设置了之前做过的基因做阳性对照
2.GFP质粒测序过是完整的且没有移码，flag的是自己构建的也反复check过没有问题
觉得很妖怪 问了当时给我质粒的人 他回复说这个蛋白可能要比计算出来的52kD大 大概在90-100kD 且因为是个膜蛋白所以可能表达起来量比较少 总之很妖怪。。。