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        【求助】小抽质粒浓度很低

        丁香园论坛

        20495
        本人最近小提质粒,挑取单克隆于3毫升LB培养基培养6小时候抽质粒,发现浓度只有50纳克每微升。
        后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时,收集10ml菌液进行离心,裂解,上柱(10ml菌液只上一个柱子,量绝对足够了吧),结果浓度才300纳克每微升,我本计划下步做转染,如此低得浓度我很是担心啊
        不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒,是高拷贝的。
        PS:我怀疑是不是抗生素失效导致杂菌污染,如果抽得质粒全是杂菌的话,测得浓度和OD值会不会和正常的质粒不一样呢?
        4小时能提出50ng已经不错了,10毫升菌液杂质也会相应增加,内毒素会影响转染效率的。

        LB摇菌对质粒小抽来说不太适合,建议用TB或SB加2mM MgSO4, 2-5毫升菌液保证供氧充分,摇24小时后加170ug/L氯霉素再摇2小时就能抽出微克浓度的质粒了。不知道你做什么样的转染,如果用量大的话完全可以做大抽。

        卡那霉素用量建议50ug/mL, 如果在TB这样含磷酸盐的培养基上必须再加到100ug/mL
        请问,解决了吗,我也遇到了这个问题,很苦恼啊。。
        313043636
        请问,解决了吗,我也遇到了这个问题,很苦恼啊。。

        提高抗生素浓度!
        用天根的中抽kit
        你3毫升才摇4小时,肯定浓度太低了,细菌都没长多少。一般都得12到16小时。
        shylook wrote:

        提高抗生素浓度!
        用天根的中抽kit

        请问一般提高抗生素浓度到多大能较好的提高质粒得浓度呢?
        紫藤花笨笨熊
        请问一般提高抗生素浓度到多大能较好的提高质粒得浓度呢?

        amp我平时用100mg/L
        上到150 没问题
        你这低拷贝?
        我的载体是pires2-egfp这个貌似是低拷贝的,自己也不大懂。载体抗性是卡那,我用的浓度是30ug/ml。这次摇的目的过表达的浓度才80ng/ul.做不了转染了。不知道提出来的质粒可以重新转化不?还是提高抗生素浓度,再摇菌……
        紫藤花笨笨熊
        我的载体是pires2-egfp这个貌似是低拷贝的,自己也不大懂。载体抗性是卡那,我用的浓度是30ug/ml。这次摇的目的过表达的浓度才80ng/ul.做不了转染了。不知道提出来的质粒可以重新转化不?还是提高抗生素浓度,再摇菌……

        提高到50ug/ml试试
        不行就换大抽 天根
        shylook wrote:

        提高到50ug/ml试试
        不行就换大抽 天根

        哦 好的 我试试先提高抗生素浓度 现在我用的是omega小提的
        紫藤花笨笨熊
        哦 好的 我试试先提高抗生素浓度 现在我用的是omega小提的
        不合算
        建议你用天根的小提中量!

        我不是天根的托
        shylook wrote:
        不合算
        建议你用天根的小提中量!

        我不是天根的托[/quote
        嗯嗯 我相信你 也很感谢你的指导。有问题再向你请教。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】小抽质粒浓度很低

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