抗体抗原实验

原位末端转移酶标记技术 （ISEL）检测细胞凋亡 根据细胞凋亡时核酸内切酶被激活，将细胞核染色体DNA从核小体连接处切断，产生单股或双股DNA链。根据这一生化特性，将外源性核苷酸和酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和DNA聚合酶I或Klenow大片段）渗入到凋亡细胞中，催化标记的外源性核苷酸与断裂的 DNA链相结合，并通过一定的显示系统显色。 由于凋亡细胞内的内源性核酸酶被激活后， ...

免疫学方法（ELISA法）检测细胞凋亡 细胞凋亡事件发生时，会出现蛋白质和核酸分子结构的改变，形成新的表位。利用免疫学方法对这些表位进行鉴定，有助于判断样本中细胞凋亡事件的发生。细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切酶的激活，这种钙和镁依赖性核酸酶容易进入的核小体间区解开双链DNA，产生单/低聚核小体片段，而核小体本身由于DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸 ...

酶标记法检测细胞凋亡【材料与试剂】（1） 平衡缓冲液；（2） 反应缓冲液；（3） TdT酶；（4） 反应终止/洗涤液；（5） 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；（6） 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS；（7） 30％H2O2；（8） DAB显色液：0.05％的diaminobenzidine （DAB）溶于PBS，用前过滤 ...

流式细胞分析术检测细胞凋亡的基本原理 流式细胞分析术在现代细胞分子生物学研究中起着越来越重要的作用。由于流式细胞分析是通过对单个细胞性状的快速测定，并结合先进的计算机分析系统，使得在短时间内可对大量细胞进行定性、定量测定。新一代流式细胞分析仪尚具有同时对单个细胞进行多参数测定的功能，可同时对细胞膜、细胞内蛋白质及核DNA进行标记后检测。 流式细胞分析术在细胞凋亡研究中具有特殊意义。 ...

亚“G1”峰检测法检测细胞凋亡 处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后，用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜，使细胞原有的DNA部分丢失，仅剩下大片段DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞分析术检测其DNA含量，会出现一个DNA含量＜2n（即＜G1期细 ...

Annexin法检测细胞凋亡基本与Annexin-V-FLUOS和PI双标记法相同，早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素（FITC）的连接素V（Annexin V），但细胞仍然保持其细胞膜的完整性，使荧光染料PI不能进入细胞（因为PI只能进入已经破损的细胞膜）；然而，坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时被Annexin与P ...

Fas抗原的检测 Fas（CD95/APO-1）分子已被证实是一种细胞表面的受体，可与Fas配体（FasL）结合，介导细胞凋亡。本法利用抗－Fas－生物素通过蛋白印迹法、流式细胞分析或免疫组化染色检测Fas/Apo-1分子。【样本来源】(1) 单层粘附细胞；(2) 细胞悬液；(3) 组织切片细胞提取物。【材料与试剂】（Roche公司试剂盒）(1) 鼠抗人－Fas-Bioti ...

PCR-SSO HLA分型技术 编码不同型别HLA抗原的基因在其碱基的顺列上存在差异，这种差异能够用序列特异性寡核苷酸探针（SSO）杂交的方法来检测。其原理是根据各种HLA等位基因的碱基序列，通过人工合成与其互补的寡核苷酸，即SSO探针；待测标本基因组DNA中的HLA基因经PCR扩增之后，与SSO探针杂交，通过观察杂交发生与否，来判断待测标本的HLA型别。 传统上PCR-SSO探针 ...

人类白细胞抗原（HLA）是分布在组织细胞表面的一组膜蛋白，它们的基本生物学功能是将抗原信息提呈给T细胞识别，从而启动和调节特异性免疫应答。根据分子结构、组织分布和生物学功能的差异，HLA抗原可以分为二类，即HLA-I类抗原（包括HLA-A、B、C）和HLA-II类抗原（HLA-DR、DQ、DP）。HLA抗原由第六染色体短臂上一组紧密连锁的基因群编码。在群体中，HLA ...

PCR-SSO标本基因组DNA提取 由于DNA分型技术以PCR扩增为基础，对待测标本DNA的量要求不高，下面介绍的是采用微量全血法提取标本DNA，也可以采用其他类型的样本和其他方法提取DNA，但提取DNA的OD260/280比值范围应该为1.8～2.0。（一）基因组DNA提取【试剂配制和仪器要求】（1） EDTA或枸橼酸钠抗凝全血约0.5ml（2） 红细胞裂解液:（0.3 ...

PCR-SSO扩增DNA固定于尼龙膜上【试剂和材料】（1）上述DNA扩增产物（2）尼龙膜（3）变性液：0.4 M NaOH 25 mM EDTA（4）中和液：20 X SSC：3 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠【操作步骤】（1） 取大小适当的尼龙膜，注意正反面，在点样面做好标记，以区分不同的样本。通常PCR-SSO分型需要多张尼龙膜，而每张尼龙膜上可以点多个样本的扩增DNA ...

PCR-SSO预杂交和杂交【材料和试剂】（1） 50 X Denhardt：2.5g聚蔗糖400，2.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），2.5g牛血清白蛋白（BSA），加蒸馏水250ml。（2） 预杂交液：5XSSPE，5Xdenhardt液，0.5%SDS，100ug/ml变性并裂解的鲑精DNA。（3） 50%甲酰胺（4） 10 X ...

PCR扩增标本的HLA-DR基因（一）扩增引物HLA-DRB1基因扩增引物为：5’-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’5’-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3’（二）PCR扩增体系（1） 1.0uM 扩增引物（2） 300ng待测样本基因组DNA（3） 2.0U Taq多聚酶（1） 200uM 各 ...

HLA等位基因序列特异性探针（SSO）及其标记（一）DRB1分型SSO探针 根据分辨率的要求选择。常用的DRB1分型的SSO探针见表代号SSO探针的DNA序列（5’-3’）DR特异性L11TTCAAACTTAAGCTGCCACDR1D11CTCATACTTATCCTGCTGCDR2N77TCTGCAGTAGTTGTCCACCDR3H33CTCTTGGTGATAGAAGTATCDR4E58C ...

PCR-SSO洗膜【仪器和试剂】（1） 洗膜液I：2XSSPE，0.5%SDS。（2） 洗膜液II： 0.1XSSPE，0.5%SDS。（3） 恒温水浴摇床（80rpm，有盖，温度可调至65℃）（4） 精确温度计（精度为±0.1℃）（5） 放射检测仪【操作步骤】（1） 杂交完成后，取出尼龙膜，并放入 ...

PCR-RFLP HLA分型技术 限制性核酸内切酶的识别位点具有严格的DNA序列特异性，不同型别HLA抗原的编码基因在DNA序列上存在差异，用一组限制性核酸内切酶对经PCR扩增后的HLA基因片段进行酶切，由于在不同HLA等位基因上限制性酶切位点的分布存在差异，酶切后的PCR产物经凝胶电泳后就会显示不同的电泳带型，借以鉴定HLA基因的型别。图10-2是采用PCR-RFLP技术进行HLA-DR ...

PCR-SSO结果显示与结果分析【仪器和试剂】（1） 感光胶片（2） 带有增感屏的暗合（3） X光片冲洗试剂和设备【操作步骤】（1） 洗膜完毕后，用塑料薄膜将其包好，与感光胶片一起装入带有增感屏的暗合中，在低温冰箱中进行放射自显影。曝光时间需要摸索，通常为数十分钟至数天，视探针的放射性比活和洗膜程度而定。（2） 曝 ...

PCR-SSP HLA分型技术PCR-SSP（sequence specific primer）分型技术是根据编码各种HLA抗原的等位基因的碱基排列顺序，设计并合成与之互补的寡核苷酸作为PCR引物，样本中HLA等位基因能够用相应的引物（即SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，SSO仅扩增与其互补结合的HLA等位基因，而不扩增其他的等位基因，PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。因此，采用S ...

PCR-SSP扩增体系的组成和准备（一）SSP引物混合液的准备预先准备好所有引物的混合液，其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分，即：（1） 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物（2） 2pmol 内参照引物（β-actin基因引物）（3） 200umol 各种d-NTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）（4） 1 X PCR缓冲液：10mM Tris-HCl ...

HLA-DR基因中等分辨率分型序列特异性引物5’-引物序列(5’ � 3’)3’-引物序列(5’ � 3’)PCR产物长度DRB1基因扩增特异性5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3’047CTGCACTGTGAAGCTCGCAC255bp0101-01023’048CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA255bp5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3 ...