细胞技术

tydyhan： 我一直做细菌这块，对病毒操作不是很懂，请教大家： 建立表达某基因的重组逆转录病毒载体的B16细胞系 含某基因的重组逆转录病毒载体已获得，需转染PA 317包装细胞，通过G418筛选获得表达某基因的重组逆转录病毒。Polybrene进行转染B16细胞，筛选阳性转化克隆，获得稳定表达的B16细胞株。这里怎么具体进行操作?? 丁香园网友adychen认为： １、首先最好选择的是带ＥＧＦ ...

wangcaixia1： 我是第一次做蛋白表达，所表达的蛋白是以包涵体形式存在的，包涵体经过洗涤、溶解后进行复性，采用不同尿素浓度（4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0）的复性缓冲液进行复性，我想请教的问题是这一系列不同尿素浓度的复性缓冲液可以重复使用吗？如果是不同的蛋白可以重复使用吗？ 丁香园网友panmo2006认为： 不知道你用的是哪一种表达载体，如果是融合表达载体pGEX时候，在透析 ...

问： 我要用6孔板作蚀斑减少试验，但是琼脂dmem加到孔里，还没加完6个空，杯子里的就已经凝固了，琼脂和dmem都是在50度水浴里的，混合后赶紧加，但是来不及。有什么办法能很舒服的加进孔里去又不凝的太快吗？ 答： 做蚀斑减少试验最关键的就是铺胶时动作即要缓慢，以防止气泡产生同时动作要快，一般六孔板加2-3毫升就够了，你可以用10毫升的吸管吸够10毫升可以加四格孔，在50度水浴里化开的琼脂完全可以加 ...

问：神经干细胞nestin和EphrinA4的免疫荧光双标怎么做？ 答： 过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1 加入一抗和二抗的时候也是混合加入 但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~ 补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。 ...

问： 单克隆抗体制备过程中在往BALB/C小鼠腹腔折注射的液体石蜡要如何处理？要高压吗？先谢谢各位！ 答： 液体石蜡不用高压，BALB/C小鼠腹腔注射0.5-1毫升，视具体情况增减，注射过液体石蜡的BALB/C小鼠，2个月内都可以使用。 ...

pl198242：请问各位大侠：用质粒提取试剂盒从大肠杆菌中提取质粒后，想用于细胞转染，还需要另外的操作来除菌么？ 另外是否还需要纯化？ 丁香园网友boboyuan认为： 不需要，当然，前提是你提取质粒时操作是规范的。 提完的质粒放－4度保存，转染的时候直接用就行了。 丁香园网友hzh_0796认为： 看你是用什么方法提得，纯度如何 我用小提的时候发现，最后一步用洗脱液洗时将吸附柱放进一个新的EP ...

报告基因的种类很多，根据对其表达产物的分析检测方法的不同，可将其分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液（分泌型报告基因）中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）、人生长激素基因（hGH）及分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）等。后者的分析可以在活的细胞或组织中，或在已经组化固定的组织或细胞中进行。较典型的如绿色荧光蛋白基因（G ...

cvn：请大家分析下我的问题：本人用六孔板共转染（pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper）包装空载体腺相关病毒，转染后48小时在荧光显微镜下看，一个视野内约有80%的绿色荧光。转染后第三天，收病毒。再将病毒原液感染种在六孔板内293细胞，48小时后在荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白。 上述的过程，本人重复了三次。均未见绿色荧光蛋白。现在本人感到疲惫。请大伙帮忙分析分析。谢谢！ 本人用脂 ...

gdgznf2008：大家看看我的293细胞状态怎样？ 适合转染吗？ 下一张 下一张 下一张 下一张 丁香园网友pmy5155714认为： 不太好至少你的细胞长的太不均匀了 而且有的细胞已经老化消化的问题 丁香园网友gdgznf2008认为： 我的细胞是师兄冻存的，也不知多少代了，我用的是0.025的胰酶＋EDTA消化的，而且尽量吹打均匀，可接种后仍然长的不均匀，呈片状生长。我 ...

paipaihe：24孔中，对已成功转染GFP的细胞进行免疫细胞化学检测 1抗使用GFP 单抗（鼠源） 2抗使用羊抗鼠的HRP标记2抗 经染色后未见任何阳性显色细胞， 请问各位可能的原因都有那些呢？ 我的具体操作是 1.4%多聚甲醛固定30分 2.triton-100 透化 15分 3.3%H2O2/甲醛 10分 4.5%BSA 60分 5.1抗 60分 6.2抗 60分 7.染色 ...

shally1108：我要做神经母细胞瘤细胞和神经胶质瘤细胞的转染。本来是用LP2000，现在想试试电转，只做瞬时表达看绿荧光就行，不需筛选。 请问肿瘤细胞的瞬时转染合适吗？把细胞消化后只用PBS重悬可以吗？电压电阻大概多少？ 丁香园网友shally1108认为： 还有个问题，实验室用的是细胞电融合仪ECM2001（BTX），它的转染杯是仪器配套可重复使用的还是一次性用自己另外买的？ 此外，我的质 ...

xuwenpku：用pTRACER转染293细胞，约70-80%汇合度，3μl lipo，2μg质粒，36h后没有表达荧光，请教可能是什么原因？另外，想问是不是lipofectamine转染，要求细胞必须是传代之后24小时以内的细胞？延长转染时间是否会有好处呢？ 在另外，pTRACER这个质粒由那位同学用过么？它的荧光表达好不好？ 丁香园网友guoguo1984428认为： 你可以用P ...

犯罪现场调查：最近作稳定转染的筛选。发现一个问题。绿色荧光细胞总是在没转染成功的细胞附近生长。而且，混合生长。怎么才能分离？难道加大418的浓度？ 丁香园网友chenlydd认为： G418加压后活下来的细胞都是转染成功的。不表达绿色荧光的细胞不代表没有转染成功，该细胞只表达新霉素磷酸转移酶基因，因而对G418产生抗性，只是该细胞不表达目的基因。 分离只表达目的基因的细胞最好用９６孔板用有限稀释法 ...

荧光素酶作为一种报告基因要在检测时比较其相对发光强度值，就要在转染时引入另外一个报告基因进行转染条件、效率的标准化归一。Promega公司在这方面有双荧光素酶检测试剂盒，就是转染时同时转入两个质粒，包括萤火虫荧光素酶催化的反应和海肾（一种来自海洋的生物发光动物──三色堇）荧光素酶催化的反应。下面是说明书的一段原话： Firefly and Renilla luciferases，because ...

羽缎：我用磷酸钙转染293T细胞，以前做得都好好的，但最近有好几次都转染后八到九小时换液，发现细胞不但不增殖，反而死了2/3，排除细胞污染的原因，HBS也换了，都找不到原因。 丁香园网友wfayew认为： 转然后8-9h？我们都是16小时 那么短的时间细胞还没有适应转染环境吧可能影响转染效率 肉眼观察你的沉淀是否均匀？如果混合时不小心的话形成大块沉淀对细胞刺激还是很大的 做没有质粒的对照组看是否转 ...

llemontree：G418 筛选Hela细胞的预试验，想确定筛选浓度，怎么1500μg/ml 仍有细胞存活呢？难道Hela细胞的抗性如此之强？应该怎么办呢？急！ 丁香园网友qiuying认为： 可能细胞已改变了遗传特性，建议重新引入HELA细胞或更换细胞株。我曾用过G418筛选转基因的HELA细胞，浓度为700μg/ml时细胞已死 丁香园网友llemontree认为： Hela 细 ...

爱吃葡萄的猫：我做稳定转染，挑完单克隆用RT-PCR鉴定时，批不出我转染的那段基因表达，但是载体上的新霉素抗性基因能批出来，我鉴定了大概20个单克隆都是这样，开始以为是引物有问题，后来鉴定瞬时转染时能表达，应该就不是引物和条件的问题。大家有没有遇到过这种情况？帮我分析一下是什么原因？急等！ 丁香园网友Sayid认为： 这种情况太常见了，也是我们还要对抗性阳性克隆进行PCR鉴定的直接原因。 由于目的 ...

独1无2：我用带GFP的质粒转染到Ca Ski 细胞可见GFP的表达，但是一天后用同样的质粒转染到BJ 细胞23小时却没有看到任何荧光，在细胞周围看见疑似细菌污染，请问细菌污染会影响质粒的转染吗？ 丁香园网友爱吃葡萄的猫认为： 我觉得应该会，因为我觉得转染对细胞也是一种损伤，所以要求转染前细胞要处于对数生长期，也就是最好的状态，但是细菌污染就会影象细胞的生长状态。但是我觉得你这次没有成功也有可能还 ...

mapan777： 不知道哪位能告诉我IL-12、IL-12p40、IL-12p35、IL-12p70之间的关系是什么啊？ 丁香园网友qdwanfeng2007认为： 我也正想研究il-12，希望能和你共同探讨一下，P40和P35是P70的两个亚基吧？ 丁香园网友mapan777认为： 是的，它们联合起来起作用，我想做PCR，但是快被这个引物折磨死了，不知楼上是要做什么? 丁香园网友qdwanfe ...

rumex：请问大家核型分析用的显微镜是什么型号的，放大倍数是多少 丁香园网友q0134134认为： 核型分析一般用研究级正置荧光显微镜，放大倍数400-1000倍，要求具有核型分析功能的软件，MetaSystems很好用。 丁香园网友rumex认为： 为什么用荧光显微镜呢我想在镜下看到染色体400-1000倍能做到么？ 另外我们也想买台荧光显微镜那么要选择什么样的荧光纤维镜参考什么参数呢？ 丁香 ...