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        如何获得稳定的细胞株

        互联网

        5942

        tydyhan:

        我一直做细菌这块,对病毒操作不是很懂,请教大家:

        建立表达某基因的重组逆转录病毒载体的B16细胞系

        含某基因的重组逆转录病毒载体已获得,需转染PA 317包装细胞,通过G418筛选获得表达某基因的重组逆转录病毒。Polybrene进行转染B16细胞,筛选阳性转化克隆,获得稳定表达的B16细胞株。这里怎么具体进行操作??

        丁香园网友adychen认为:

        1、首先最好选择的是带EGFP逆转录病毒载体,方便以后的转染率和感染率的观察.

        2、重组载体;

        3、得出载体抗性基因的抗生素最佳细胞筛浓度,比如说,你用的是PLEGF载体,抗性为G418,按不同的浓度检测如:200μg/ml、400μg/ml----1200ug/ml共6个梯度,细胞量最好的1000Cell/ml,以10-14天最低浓度至全部细胞死亡为最佳浓度,我用的是PT67最佳浓度为800ug/ml

        4、转染,观察24-48h的转染情况,如达40%以上,可加入G418筛选,3-5天换一次带药的培养液,一般在15天即可,具体还看转入不同基因可以有差异,得到较高带EGFP的细胞。

        5、扩大培养,收集上清。

        6、收集到的上清可以做密度梯度离心浓缩病毒。分装冻存在-80C冻箱里。

        7、病毒滴度检测,按以上3的方法,筛出B16最低全部细胞死亡浓度,把病毒液稀释成(0、-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10)梯度,分别感染同等量1000cell/mlB16细胞。以全部细胞死亡的最高稀释倍数为最终病毒滴度。

        8、以最佳滴度感染B16,并在24-48h 观察感染率,48h 后加入G418筛选。历程一般要1-2个月。

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