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        🔥 分子克隆实操技术

        相关实验:🔥 分子克隆技术

        别名:Molecular Cloning,Molecular Cloning ,DNA分离

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 张荣钊博士

        病原生物学 福建医科大学

        材料与仪器

        步骤

        1、首先合成引物对目的基因进行 PCR 扩增,将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,并回收目的 DNA 片段。

        2、将目的 DNA 片段和载体质粒进行酶切,回收后进行连接,建议 4 ℃ 连接过夜。

        3、转化感受态细胞。取出感受态细胞置于冰上融化,加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min,42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min。

        在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL,轻轻混匀放置于 37 ℃ 摇床中 200 rpm 震荡培养 1 h 后,5000 rpm 离心 5 min 收菌,留约 100 μL 上清轻轻吹打混匀,均匀涂布接种于含抗生素的固体 LB 平板中,倒置于 37 ℃ 培养箱中培养 12~16 h 左右。

        4、筛选阳性克隆。挑取单个菌落于 1.5 mL EP 管中,振荡培养 1~2 h 后取 1 μL作为模板,进行菌液 PCR 验证,观察是否出现目的条带。

        5、试管扩大培养。将上述验证正确的菌液,加入 5~20 mL 含抗生素的 LB 肉汤培养基,37 ℃ 摇床培养过夜(12~16 h),按照质粒抽提试剂盒进行提取,可以再次酶切或者测序验证。

        来源:丁香实验

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