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        求助大佬:分枝杆菌电转化长糊

        相关实验:🔥 分子克隆技术

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        了然H18G

        图片描述

        大佬快救救孩纸吧,实在解决不了了。

        问题描述和排除途径:

        如上图,分枝杆菌电转后涂板,一天就长成这样的糊状。

        实验过程:感受态制备:1%接种野生型分枝杆菌至50毫升7H9培养基,长至0.8-1.0,拿出放冰箱,4度冷孵1.5h,6000rpm离心十分钟,分别用25ml、12ml、6ml的冰10%甘油洗,最后用适量冰10%甘油重悬。电转:电转杯分别用酒精、无菌水,冰10%甘油洗涤两次,最后一次洗完后置于冰上,同时将质粒加入感受态,冰上半小时,转入电转杯,2500V、25uF、1000欧、2mm。

        1.怀疑做感受态的菌本身有问题。

        排除:换了不同来源的保种,糊。

        2.做感受态的菌抗性原因。

        排除:一级种没有抗性,同批抗生素在大肠种使用也具有效果。

        3.抗生素本身质量问题。

        排除:加大抗生素比例,在常规基础上扩大了2倍、3倍,糊。

        4.转化质粒问题。

        排除:选了不同抗性的重组质粒和空质粒,糊。

        5.质粒加的多少问题。

        排除:200ul的感受态,分别尝试过加如800ng、1700ng、3400ng等不同量,糊。

        6.电转后涂布的多少问题。

        排除:一般用200ul重选,试过10ul、50ul、80ul、100ul、200ul等不同量,糊。

        7.感受态问题。

        排除:不同人做了感受态,感受态的浓度,4度冷孵时间都变过,糊。

        7.感受态污染。

        排除:同一管感受态电转复苏后,部分涂布,同时划线,划线没杂菌。

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        4 个回答

        user-title

        酉月W27X

        有帮助

        请问解决了吗?我现在也是一直糊板

        user-title

        guokeguiren

        有帮助

        求助大佬怎么制备分枝杆菌感受态细胞,我只背的就没有电转成功过,哭死

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        如果是凃的时候是糊状就是正常现象。感受态里有氯化钙显得发糊。

        如果是长成糊状的可能抗生素失效,或者质粒太浓。

        user-title

        了然H18Guser-title

        多谢。感受态是自己做的,不含有氯化钙。抗生素在其他实验中验证过,正常没失效。质粒也尝试过不同量的转化,都糊了。

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        有没有继续做后面的验证?我之前做另一种菌也是这样,每次电转后都长非长满,后面我就涂两个板,用同一个玻璃棒涂完第一板之间涂第二板,第二天第一板还是满的,第二板可以挑出单克隆,我就直接送测序,挑了7、8个测序结果都是正确的。

        user-title

        了然H18Guser-title

        多谢答疑。涂布的板全是雪花,挑不到单菌落。不过我最近一次电转后同批划线了,今晚已挑斑,明天可以PCR验证一下

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