合作专家 | 吴宇晨硕士
生物学 厦门大学
审核专家 | 王淼博士
病原微生物 中国农业科学院
简介
利用一次 PCR 方法进行定点突变分子克隆，较盒式突变及其它传统方法更快速简便。
原理
PCR 原理: 在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。
DPNⅠ酶消化原理：DPN1 是一种限制性核酸内切酶，能够特异性切除甲基化的 DNA 链。定点突变后，我们需要区分并去除原始 DNA（未突变模板）。模版质粒来源于大肠杆菌，是经 dam 甲基化修饰的， DpnⅠ识别甲基化的 GATC 中的 A，而 GATC 在几乎各种质粒中都会出现，且不止一次，因而模板链对 DpnI 敏感而被切碎；而体外合成的带突变序列的质粒来源于 PCR 没有被甲基化，不能被 DpnⅠ识别剪切，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
用途
用于在质粒中引入少数碱基的定点突变。
材料与仪器
① 模板质粒
② 高保真 PCR 混合酶（诺唯赞，P520-01）
③ 合成引物序列
④ 去离子水
步骤
一、设计引物
如图在欲突变位点设计 PCR 定点突变所需引物，设计的引物需含有突变后碱基序列，订购引物。
二、质粒 PCR
将稀释好的质粒模板与订购的引物以及其他试剂按如下比例混合（50 μl）：
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10 μM 正向引物 |
1 μl |
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10 μM 反向引物 |
1 μl |
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模板 cDNA（20~200 μM） |
2 μl |
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2×高保真PCR混合酶 |
25 μl |
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去离子水 |
21 μl |
将混合好的体系进行 PCR，程序如下：
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① 预变性 |
94 ℃ |
1 min |
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② 变性 |
98 ℃ |
10 s |
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③ 退火 |
58 ℃ |
30 s |
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④ 延伸 |
72 ℃ |
X min |
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⑤ 充分延伸 |
72 ℃ |
10 min |
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⑥ 保存 |
4 ℃ |
∞ |
步骤 ②-④ 重复 28 次循环。 根据酶的扩增效率及目的片段大小选择延伸时间。例如：酶的扩增效率为 1 000 bp/min，质粒大小为 9 000 bp，则 X 为 9 min。
三、DPNⅠ 酶消化
将 PCR 后的产物和 DPNⅠ 按一下比例混合，消化模板质粒：
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PCR 产物 |
4 μl |
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DPNⅠ |
0.5 μl |
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cut buffer |
1 μl |
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去离子水 |
4.5 μl |
四、转化
将连接好的完整质粒，转化 DH5-α 感受态细胞中，冰上孵育 30 min，42 ℃ 热击 90 s，再置于冰上冷却 5 min，完成转化。用稀释涂布法将感受态溶液涂至含有相应抗性的 LB 固体培养基表面， 37 ℃ 培养箱中过夜培养，次日会长出菌落，挑取菌落进行测序。
注意事项
1、模板投放量不应过高，会使得消化不完全，长出未突变的菌株。
2、循环数不应该太多，18 个循环足够，由于 PCR 区域是整个质粒，时长会很久，在循环后期酶的活性可能会下降，保真性变差。
常见问题
1、PCR 后无条带，可能是引物设计中 GC 含量过高，导致引物碱基数过少，应尽量延长引物长度。
2、若测序阳性率低，检查模板投放量是否过多，或 DPNⅠ 酶失活，使得消化不完全，长出未突变的菌株。
3、若未长出菌落，检查模板质粒是否变质，或实验过程是否有其他意外。
来源：丁香实验
