蛋白质实验

来源：《蛋白质组学：从序列到功能》

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多种用于蛋内质组学研究的蛋白质分离方法得到了发展，如基因芯片技术的应用. 蛋白复合物的质谱直接分析、亲和标签的使用以及大规模酵母双杂交筛选系统。但是，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE) 依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白混合物所选择的核心技术，这是由于它在同时分离成千蛋白质时所具有的无可比

长期以来，许多的研究者希望 IHC 方法更敏感、更稳定、更简单，要求多步检测系统简化，但敏感性要进一步提高，使这一技术面临巨大的挑战。在实践中，往往是步骤减少了，敏感性也降低，这是一对矛盾。一种新的多聚螯合物酶二步法在 1995 年被隆重推出，该方法与简单的二步法相比较，具有很高的敏感性、稳定性和特异性。另一种是以多聚糖为骨架的多聚螯合物，主要用于 PowerVision 法，其敏感性好于 EnV

凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析这种方法利用分级分离，而不需要蛋白质的化学结合，这就明显降低了因不可逆结合所致的蛋白质损失和失活。另外，可利用此法更换蛋白质的缓冲液或降低缓冲液的离子强度。在蛋白质纯化操作中何时使用凝胶过滤，还不能一概而论，有时纯化到某一步时适用凝胶过滤。纯化一个分子量较大的蛋白（例如：超过 100 KD）， 纯化的第一步可使用

离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。它对蛋白质的分辨率高，操作简易，重复性好，成本低。按照离子交换原理，蛋白质可从大量缓冲性溶液中被分离，所以此方法尤适于蛋白质粗提物的初始纯化。在分离蛋白质时，速度往往是很重要的。 如蛋白酶的初始分离和不稳定蛋白质的纯化。离子交換层析提供了很多加速分离的手段。这些特点使离子交换层析成为极具价值的蛋白质纯化手段和设计蛋白质纯化方案时可行性很强的出发点。

一种基于光学现象的体外技术被称作表面等离子共振（SPR），它能够同时检测未被修饰蛋白之间的相互作用并直接测量相互作用的动力学参数。研究大分子之间相互作用的 SPR 技术的使用随着用户界面友好的仪器的开发变得流行。其中用得最广泛是 BIAcore 仪器（BIAcore）。这种仪器包括感光元件、自动进样系统和用于仪器控制、数据收集及分析的电脑组成。内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

相互作用克隆（也称表达克隆）用于确认并克隆编码与目的蛋白或「诱饵」蛋白相互作用的蛋白质。这种方法绕过了纯化、微量测序或抗体制备等必要过程。来源《精编分子生物学实验指南（第五版）》

通过确定与之结合的其他蛋白质来理解某种特定蛋白质的功能，常常是十分有用的方法。这可以通过从文库中选择或筛选与靶蛋白相互作用的新蛋白来实现。现有一种特别有用的方法即双杂交系统或相互作用阱， 用来测定新的相互作用蛋白，这种方法采用充当「试管」的酵母菌和一种报道系统的转录激活作用来识别结合蛋白。本方法也可以用来测试两个预测的具有相互作用的蛋白质之间是否形成复合物。来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）

哺乳动物蛋白质的生化分析和功能研究常因为得不到纯化的蛋白质而受阻，尤其是当所研究的功能实体在细胞内是多亚基蛋白复合体的时候。为了克服从哺乳动物细胞中纯化多亚基蛋白复合体的困难，可以制作包含抗原决定簇标记蛋白的稳定转染细胞系。由于抗原表位标记的蛋白质在细胞内可以以不同的复合物形式存在，因此，分离不同形式的多亚基蛋白复合物也很重要。本实验介绍四种。内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

内容来源于《精编分子生物学实验指南（第５版）》

蛋白质和多肽是由 20 种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链。再通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定构象而产生其特异性的活性作用。蛋白质的一级结构即氨基酸的排列顺序，决定了蛋白质的高级结构及功能。因此。测定蛋白质的一级结构是进行蛋白质结构与功能研究中不可缺少的部分。随着研究方法和手段的更新，蛋白质一级结构的分析向提高灵敏度、缩短周期的方向发展。来源：《蛋白质技术手

疏水相互作用层析是以介质疏水基团和蛋白质疏水区域间的亲和作用为基础的。疏水力是浸在一种极性液体（如水）中的非极性物质的排斥力。胞膜蛋白都具有一个明显的疏水区域以锚定在膜上。可溶性蛋白质在外表面上可能存在疏水小区，它促进蛋白复合物的形成，也可能是疏水配基结合部位或活性部位。这些暴露的疏水区对疏水层析纯化而言足非常理想的。尽管疏水层析利用相对非持异的亲和力分离纯化蛋白质，而且不具有高分辨率，但是该法很

染料配基层析不是真正意义的亲和层析，因为它们并不是与它们结合的蛋白质的天然配基。然而染料柱能很好地结合蛋白质，并能导致满意地纯化蛋白质。事实上，有时这种结合甚至比正常的配基更紧。染料配基柱通常是廉价和稳定的，并且具有较高的蛋白质结合容量。所以染料配基层析能作为蛋白质纯化中有价值的步骤之一。来源：《蛋白质技术手册》

凝集素是能可逆性结合碳水化合物的蛋白质。因为绝大多数凝集素至少每个分子有两个碳水化合物结合部位，所以它们可以沉淀糖蛋白和凝集细胞。凝集素也就可以用作糖蛋白的亲和配基，具有单糖的糖蛋白可用温和的蛋白质冼脱条件分离。虽然凝集素亲和层折没有很高的选择性，但是无疑它已成为蛋白质纯化的一种常用方法。它通常作为系列纯化步骤之一。凝集素亲和柱也可用于除去作为污染物的糖蛋白。来源：《蛋白质技术手册》

核酸亲和柱的应用极大地促进了核酸结合调节蛋白特性的研究，这些蛋白质涉及基因表达、染色体修复和复制、基因重组等的调控。核酸结合蛋白可以结合单链 DNA、双链 DNA 或 RNA。DNA 结合蛋白结合 DNA 可以是序列特异的，也可以是非特异的。此外，含有特异寡核苷酸的亲和树脂能用于某些酶的分离，这些酶利用结构非常相似的辅酶，如 NAD 和 NADP。总之，核酸亲和柱在各种蛋白质的纯化和特性研究中是一

在蛋白质纯化方法中抗体亲和纯化是非常有效的方法之一。仅此一步常可获得 1000～10 000 倍的纯化。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明，并且洗脱的目的蛋白没有受到不可逆的损伤，那么可以认为免疫纯化是极好的蛋白质纯化方法，特别是用在纯化过程的最后步骤。来源：《蛋白质技术手册》

本节将重点叙述用溴化氰活化的琼脂糖凝胶配体固相化技术。绝大多数配体，如多肽、蛋白质、凝集素和核酸，都能较容易地用该法偶联。来源：《蛋白质技术手册》