抗原标记蛋白复合体纯化实验
蛋白质实验
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简介
哺乳动物蛋白质的生化分析和功能研究常因为得不到纯化的蛋白质而受阻，尤其是当所研究的功能实体在细胞内是多亚基蛋白复合体的时候。为了克服从哺乳动物细胞中纯化多亚基蛋白复合体的困难，可以制作包含抗原决定簇标记蛋白的稳定转染细胞系。由于抗原表位标记的蛋白质在细胞内可以以不同的复合物形式存在，因此，分离不同形式的多亚基蛋白复合物也很重要。本实验介绍四种。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
来源：丁香实验
操作方法
1. 将 FLAG 标记蛋白编码序列克隆到含有药物筛选标记（如新霉素）的逆转录病毒载体。2. 转移 20 μg 到 5 ml 圆底 Falcon 试管中并与 0.5 ml 2 × HeBS，pH 7.12 混合。3. 逐滴加入 0.5 ml 0.25 mol/L CaCl2 同时涡旋混匀。室温放置 20～30 min。4. 激烈涡旋混匀 DNA-磷酸钙共沉降物，将混合物加入 50% 汇片的 ψ C
条件性表达FLAG标记1. 将蛋白编码序列克隆到一个含有 FLAG 抗原序列的四环素调控表达的质粒中，如 pTetCMV-F°（S）。2. 混合 10 μg 线性化的四环素调控的 FLAG 标记蛋白表达质粒 [如使用 PvuI 来线性化大多数 pTetCMV - F°（S）衍生构建物] ，50 μg 剪切过的小牛胸腺 DNA 和 0.5 μg SacI 线性化、含有潮霉素筛选标记的 pREP4 至电穿孔杯。3. 胰酶-
变化起始材料和洗脱条件1. 纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶：1.1 建立一个 HeLa 细胞衍生的、四环素调控的、条件性表达 FLAG 标记的人 pol II 亚基的细胞系。按照「条件性表达 FLAG 标记」步骤 1～20 描述的方法制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸。1.2 从核抽提物或 S100 中免疫亲和纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶，按照「组成型表达 FLAG 标记」步骤 26～
用P11离子交换层析柱1. 用逆转录病毒介导的转基因建立一个 HeLa 细胞衍生的表达 FLAG 标记的人 TBP 的细胞系，并且按照基本方案 1 步骤 1～24，从建立的细胞系中制备核抽提物、S100 和核团块。2. 在一个层析柱中装一个约含 60 ml 树脂的 P11 离子交换柱。3. 将柱连到一个流体适配器、图表记录器和样品收集器上，用 BC100 平衡整个系统过夜。流速设置为每小时约 1 个柱体积（CV），即
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