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        核酸亲和层析法纯化蛋白质实验

        实验分类:

        蛋白质实验

        最新修订时间:

        简介

        核酸亲和柱的应用极大地促进了核酸结合调节蛋白特性的研究,这些蛋白质涉及基因表达、染色体修复和复制、基因重组等的调控。核酸结合蛋白可以结合单链 DNA、双链 DNA 或 RNA。DNA 结合蛋白结合 DNA 可以是序列特异的,也可以是非特异的。此外,含有特异寡核苷酸的亲和树脂能用于某些酶的分离,这些酶利用结构非常相似的辅酶,如 NAD 和 NADP。总之,核酸亲和柱在各种蛋白质的纯化和特性研究中是一个有用的工具。

        来源:《蛋白质技术手册》

        来源:丁香实验

        操作方法

        步骤一 偶联寡核苷酸到溴化氰活化的 Sepharose 4B

        1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中,室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤,当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候,立即停止抽滤;2. 胶在漏斗内,依次用 4℃,200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗;3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L,pH

        步骤二 核酸亲和层析

        在上样品液到核酸亲和柱之前,建议首先采用其他的纯化方法,如硫酸铵沉淀、离子交换或凝胶过滤层析等富集目的蛋白。这样可以除去绝大多数的污染物,并减少非特异结合。亲和层析柱一般来讲是短而粗的,例如长宽比为 2:1。1. 10 倍柱体积的平衡缓冲液(20 mmol/L,pH 8.0 Tris-HCl,0.15 mol/L KCl,1 mol/L EDTA)平衡柱;2. 调整样品液到相似的离子浓度(即 0.

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