原位杂交实验技术服务

一、实验原理

• RNA 原位杂交（RNA-ISH）：检测特定 mRNA 的时空表达；
• DNA 原位杂交（DNA-ISH）：定位基因组 DNA 序列（如染色体异常）；
• 荧光原位杂交（FISH）：用荧光染料标记探针，可多重检测。

二、实验流程（以 RNA-ISH 为例）

（一）样本制备

1. 组织固定
   • 常用 4% 多ju甲醛 / PBS 溶液，4℃固定 2-24 小时（根据组织大小调整），避免过度固定导致核酸降解或探针 accessibility 下降。
   • 固定后用 PBS 漂洗，经梯度蔗糖（10%→20%→30%）脱水，OCT 包埋后冰冻切片（10-20 μm），或石蜡包埋（需注意脱蜡步骤对 RNA 的保护）。
2. 细胞样本
   • 细胞爬片用 4% 多ju甲醛固定 10-15 分钟，0.1% Triton X-100 通透 5 分钟，避免细胞脱落。

（二）预处理

1. 脱石蜡与水化（石蜡切片）：
   • 二甲苯 Ⅰ/Ⅱ 各 10 分钟→无水乙醇→95%→85%→70% 乙醇，每步 5 分钟，最后蒸馏水漂洗。
2. 抗原修复与通透化：
   • 蛋白酶 K（1-10 μg/mL）37℃处理 10-15 分钟（增强探针渗透），或柠檬酸缓冲液（pH 6.0）微波修复（DNA 杂交常用）。
3. 预杂交：
   • 含 50% 甲酰胺的杂交缓冲液 37℃孵育 1 小时，减少非特异性结合。

（三）杂交

1. 探针制备：
   • 设计特异性探针（长度 50-500 bp），通过 PCR 或体外转录标记（地gao辛 - dUTP、生物素 - 16-dUTP 或荧光染料如 Cy3、FITC）。
   • 探针浓度优化：通常 10-100 ng/μL，需预实验确定最佳浓度。
2. 杂交反应：
   • 探针与杂交缓冲液（含甲酰胺、氯化钠、肝素等）混合，95℃变性 5 分钟，冰浴冷却后滴加于切片，覆盖盖玻片或杂交膜。
   • 湿盒中 37-55℃（根据探针 Tm 值调整）孵育 12-16 小时（过夜），避光操作。

（四）杂交后洗涤

1. 高严谨性洗涤：
   • 2×SSC（含 0.1% SDS）55℃洗 15 分钟→1×SSC 55℃洗 15 分钟→0.5×SSC 55℃洗 15 分钟，去除非特异性结合探针。
2. 缓冲液平衡：
   • PBS 或 TBS 洗 2 次，每次 5 分钟，为后续显色做准备。

（五）信号检测

1. 非放射性检测（地gao辛标记为例）：
   • 抗地gao辛抗体（碱性磷酸酶偶联）37℃孵育 1 小时→NBT/BCIP 底物显色（蓝紫色沉淀），显微镜下观察至信号清晰后终止反应（蒸馏水冲洗）。
2. 荧光检测（FISH）：
   • 荧光标记抗体（如 Alexa Fluor 偶联）室温孵育 1 小时，DAPI 复染细胞核，抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。

（六）封片与拍照

• 水溶性封片剂（适用于显色法）或抗淬灭封片剂（FISH）封片，避免气泡，避光保存。

三、关键注意事项

1. 防核酸降解：
   • 所有耗材经 DEPC 水处理，实验戴手套，避免 RNase 污染（RNA-ISH 尤其重要）。
   • 固定后尽快处理，避免长时间室温放置。
2. 探针设计与验证：
   • 避免探针与同源序列交叉杂交（BLAST 比对），正义链探针作为阴性对照。
   • 探针标记效率影响信号强度，可通过斑点杂交验证。
3. 杂交条件优化：
   • 甲酰胺浓度影响杂交严谨性（通常 50%），温度每升高 1℃，杂交效率降低 10%。
   • 洗涤温度需接近探针 Tm 值（Tm=81.5+16.6 log [Na+]+0.41 (% G+C) - 0.61 (% 甲酰胺) - 600/length）。
4. 对照设置：
   • 阳性对照：已知表达靶基因的组织（如 β-actin 在多数细胞中表达）；
   • 阴性对照：正义探针杂交、无探针杂交或 RNase 预处理（RNA-ISH）。

四、应用领域

1. 基因表达定位：
   • 神经科学中检测神经递质受体 mRNA（如 NMDA 受体在海马的分布）；
   • 发育生物学研究基因时空表达（如 HOX 基因在胚胎中的模式）。
2. 病理诊断：
   • 检测病毒核酸（如 HPV、EBV）在肿瘤组织中的定位；
   • 染色体异常检测（FISH 用于乳腺癌 HER2 基因扩增分析）。
3. 细胞生物学：
   • 分析长链非编码 RNA（lncRNA）在亚细胞结构中的分布。

五、结果分析与定量

1. 定性分析：
   • 显色法：蓝紫色颗粒定位靶核酸，结合尼氏染色（神经元）或 HE 染色（组织形态）辅助定位；
   • FISH：荧光信号（如绿色 FITC、红色 Cy3）与 DAPI（蓝色）叠加，观察共定位。
2. 定量分析：
   • 图像分析软件（ImageJ、QuPath）统计荧光强度或阳性细胞数；
   • 半定量评分：按信号强弱（-、+、++、+++）或阳性细胞比例分级。