T细胞免疫组库(T cell Repertoire,TR)是指在任何指定时间,某个个体的免疫系统中所有功能多样性T细胞的总和。T细胞免疫组库测序(T cell Repertoire Sequencing, TR-SEQ)是以 T 淋巴细胞为研究目标,以PCR技术来扩增T细胞受体(TcR1)的全基因序列,再结合高通量测序技术,全面评估免疫系统的多样性,深入挖掘免疫组库与疾病的关系。
T 细胞属于人体免疫细胞,它在肿瘤免疫治疗,自身免疫疾病以及移植耐受等方面发挥着重要的作用。每个 T 细胞都有自己特殊的 T 细胞受体 (TcR),就像每一个细胞的身份证。对TcR测序分析可以准确监测我们免疫系统对疾病和治疗的反应,可以帮助科研者了解疾病与免疫系统的相互作用。
TcR 作用是识别抗原。T 细胞通过细胞表面的 TcR 来识别抗原呈递细胞带来的抗原,每一个 T 细胞含有一个特异的 TcR 用来识别相对特异的抗原。T 细胞通过 TcR 基因的重组从而达到其多样化 (Diversity) 的特点(如下图),并可识别各种抗原与之反应。
T 细胞受体是由α链和β链组成的(如下图)。TcR 转录子是通过基因组里的α链或β链上的 V,(D),J 基因随机排序出来的。抗原主要结合的区域叫 CDR3 (Complementarity Determining Region 3),TcR 会经常出现核苷酸随机重组,所以每个人的 T 细胞受体就会有很高的多样性,这样就造成了 T 细胞受体的种类理论上会高达 1018 种。所以对健康人和病人的 T 细胞受体测序是做好预防医学和个性化治疗的基础。
Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al.
ImmuHubTM通过基于第二代高通量基因测序技术为血液、骨髓或组织样本提供非常全面的 TcR 测序分析。我们会对测序后数据进行详细得生物信息学处理和数据分析,并且能保证每个样本的测序过程和分析结果在整个实验中的一致性,最大程度得减少实验结果误差。
ImmuHubTM技术优势
1) 我们的检测分析更加全面准确,更少实验误差
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很多实验室采取地是对 DNA 测序的方法,因为 gDNA 的提取与纯化相对简单,但如果通过 gDNA 来测序将会面临很多与准确性相关的问题。比如,TcR 上位于 C 区和 V-(D)-J 区之间有大量的内含子,这样会因为引物与不相关的内含子的非特异识别从而增加 PCR 扩增时候的背景杂质,导致引物的不必要消耗和增加结果误差。而我们能有效的提取 RNA 并且提供基于 RNA 的分析检测,这样除去了内含子,避免了以上提及的问题,还有提供的信息是基于表达的(有功能的)T 细胞受体 (TcR) 的优势。
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大多数实验室的 PCR 扩增技术都是采用多重引物扩增的方法,多重引物的方法会影响样本备制时候的准确性。我们采用的是“单对”引物的方法,这样可以减少扩增时候的误差,同时能提供一个高精度的结果分析,也解决了多重引物法中混合引物扩增偏好性的问题。
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多重引物扩增的方法是通过已知的 TcR 序列来设计的,在进行样本 备制的时候常常会忽略一些未知的序列,往往这些未知的序列有可能会是科研新发现的关键。我们的“单对”引物是能扩增 TcR 中的全 V-(D)-J 序列(包括 FR1-4 和 CDR1-3),这样能有效的发现一些全新的外显子基因,使科研内容不仅仅局限于数据库里的已知基因。
2) 快速的检测分析
T 细胞受体(TcR)测序服务步骤
服务流程:客户提样本,通常为全血、骨髓、单个核细胞、分离后的T细胞、RNA/cDNA或者石蜡包埋的组织[FFPE],送达公司实验室后,实验室根据样本的情况,进行血液或骨髓的T细胞分离→ RNA 提取→ cDNA 合成→第二代基因测序→生物信息学处理→数据分析和出图→临床信息分析(如下图)。 45个工作日后客户获得测序结果报告。
• 提取样本 RNA
我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA,RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用,我们的每一步都会通过先进的设备,如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.),对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好,我们不会进行下一步,我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。
• cDNA 合成和基因扩增
我们合成 cDNA 将使用 5’ RACE PCR 技术来扩增 TcR 基因。
基于UMB的超强纠错
在原始RNA模板扩增前加入UMB(Unique Molecular Barcode,独立分子条形码)进行文库构建,可对后续PCR反应或测序过程中的错误进行有效纠正,还原真实的数据,完全杜绝PCR错误和测序错误,从而提高准确率。 模拟无PCR化测序,还原PCR之前的真实分子数量。
• 高通量测序
我们将使用 MiSeq® (Illumina Inc.) 2 × 300 bp pair-end 方法来对 TcR 进行测序,保证 TcR 的全长序列都可获得。
• 数据分析
TcR 的测序数据将通过我们的生物信息学分析算法进行处理。
基本数据分析将会包含以下信息:
TcR种类数和FR1-4,CDR1-3 的序列
V-(D)-J-C gene ID 信息
每一个 V-(D)-J 序列的组合信息
多样性指数的计算、克隆群比例
绘制V/J基因表达的2D、3D图
深度数据分析:
TcR状态的统计、总结、谱系等
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计算样本的统计总结:序列读数、平均克隆种类大小,无功能克隆种类数等
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计算样本每个V和J基因的使用率,绘制基于标准分数(z-Score)的热力图(heatmap)
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计算CDR3克隆种类长度的高斯分布,绘制前N个最高表达CDR3克隆的谱系图
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绘制V-J基因配对频率图、3D森林图
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基于CDR3基因长度,计算和绘制V基因的分布图
样本TcR多态性和克隆性评价
样本间TcR克隆种类重合、共享分析 (overlap and sharing)
我们也将按照客户的要求提供更多的分析和不同的数据报告形式,数据结果将以电子文档的形式传送给客户。
TcR测序的部分科研应用方向
【1.】 T细胞受体基因的专业术语起初是两个字母——“TR”,由国际人类基因命名委员会(HGNC)1999年审核通过。因而当提及到基因、基因座和链时,TR应该是最准确的描述。不过TcR是目前用得最广泛的。但是,大写的 ”TCR“ 缩写混淆了基因命名,应该避免。
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