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- 2026年01月04日
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上海达为科生物科技有限公司
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分子克隆与质粒载体构建
一、实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二、实验流程
目的DNA的扩增和纯化；
连接反应；
电泳检测连接产物。
三、客户提供
样本DNA，基因序列，试剂盒。
四、公司提供
构建好的载体，电泳胶图，测序结果。
实验周期：大约1-2月。
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文献和实验体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA ，供限制酶切割等分子克隆 操作之用;从离心后的上清液中，可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA (ss DNA )供DNA 序列分析，体外定位突变等使用。 (二)噬粒(phagemid)在质粒DNA 中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA ，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf(-)就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备
重组插入目的片段，启动子，终止子等是构建完整表达框时所需要的元件，标签序列等可以用于表达鉴定等实验。在质粒载体设计及构建工作中，根据实验的需求情况可以增减质粒载体上的具体元件，以及插入实验需要的相关基因。 2、质粒载体构建的常规流程 通常质粒载体构建的操作需要经过下图所示流程。其中目标序列确定需要根据实验需求以及查阅生物信息数据库的相关序列来确定。目标序列 PCR 扩增则根据实验需求以基因组 DNA 或者反转录得到的 cDNA 为模板，经过高保真 PCR 实验扩增得到相关目的片段。质粒载体确定由实验
说明都显示单片段插克隆效率> 95%——片段越多效率会下降的）。市售产品中，是否包含感受态细胞，是否包含质粒纯化试剂或者 PCR 纯化试剂，都会影响产品单价。 后继的筛选验证工作同经典方法一样——抗性筛选，挑克隆扩增纯化，电泳+酶切或者 PCR 验证，最后挑几个最有可能的克隆去测序验证。如今分子克隆中的 PCR 一般都会选择高保真酶——出错率比 Taq 低得多、扩增长片段效果更好，要是几十 kb 还得是 EX 加长版高保真酶——相比后继测序验证的费用，这钱万万省不得的。 总而言之，基于同源序列的无缝
