单细胞测序平台/技术原理介绍

10X Genomics
10X Genomics 公司的 Chromium 系统利用 8 通道的微流体“双十字”交叉系统，将含 barcode 的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微体系）。GEMs 形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量 barcode 序列，随后 mRNA 逆转录产生带有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，构建标准测序文库，其中 10X barcode 用于区分细胞，UMI 用于区分 mRNA 分子。

▲10X Genomics（技术原理）

BD Rhapsody

BD Rhapsody 技术利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记微球上实现单细胞捕获和 mRNA 转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于 cDNA 扩增和文库构建。可满足 100~10000 个细胞的自动分选、扩增及建库。

▲BD Rhapsody（技术原理）

SMART-seq
2012 年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技术 。在 2013 年，Nature Methods 杂志上报告了新的方案，被称为 Smart-Seq2，随后在 2014 年他们有公布了详细的操作流程 [3]。获取单细胞并裂解细胞后，含有 oligo-dT 的引物与 mRNA 的 poly- A 结合，逆转录酶 MMLV 进行逆转录，逆转录酶到达 mRNA 5’末端时，MMLV 的末端转移酶活性会在一链 cDNA 的 3'末端增加额外的胞嘧啶，这时 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 结合到第一链末端的胞嘧啶，然后以第一链 cDNA 为模版进行延伸合成互补的第二链，全长 cDNA 经过 PCR 扩增后进一步进行测序文库的构建。

▲SMART-seq（技术原理）
 

单细胞数据分析结果展示（部分）：

▲图 Loupe Cell Browser 展示细胞分群及 peaks


▲图 单细胞 ATAC 测序细胞类群注释结果


▲图 单细胞RNA测序 数据质控及过滤

▲图 单细胞RNA测序 去除批次效应


▲图 单细胞 RNA 测序 样本间的功能差异分析


▲图 单细胞 RNA 测序 细胞亚群注释


▲图 单细胞 RNA 测序拟时序 GO 注释


▲图 单细胞 RNA 测序 Marker 基因分析


▲图 单细胞 RNA 测序 细胞亚群的功能富集分析


▲图 单细胞 RNA 测序 拟时序分析


▲图 单细胞 RNA 测序 细胞亚群的功能富集在样本间的差异


▲图 单细胞 RNA 测序 拟时序分化转录因子调控网络


▲图 单细胞RNA测序 细胞通讯网络


▲图 空间基因表达 每个 spot 特异表达的基因数统计（盗图必究）


▲图 空间基因表达 聚类结果及切片 spot 位置分布展示（盗图必究）


▲图 空间基因表达 所有 cluster 选择 top5 基因绘制小提琴（盗图必究）


▲图 空间基因表达 特定 pathway 功能富集分析（盗图必究）