双荧光素酶报告基因实验

英拜公司双荧光素酶报告基因实验系统采用荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统。
实验中，一个报告基因（荧火虫荧光素酶）活力的改变，与基因表达的特定实验条件相关，而第二个报告基因（海肾荧光素酶）的组成性活力提供了内对照，使实验值可以规一化。我们在单管中测试两个荧光素酶报告基因，此两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围和对仪器参数的要求。荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶测试的组合，提供了双遗传报告基因应用的理想测试系统。我们选用的使萤火虫和海肾荧光素酶具有最适测试的灵敏度和稳定性。

可检测的内容:
1、启动子活性和转录因子结合位点分析实验
2、microRNA靶基因验证实验
3、microRNA-circRNA(lncRNA)靶基因验证实验

■双荧光素酶报告基因系统的组成

1.荧光素酶报告基因载体

①萤火虫荧光素酶报告基因载体 pGL3 Luciferase Reporter Vector 具有萤火虫荧光素酶报告基因，但该报告基因不含启动子，不能表达萤火虫荧光素酶。在该报告基因前导入外来启动子，相应转录因子与外来启动子结合，影响荧光素酶报告基因的表达。我们首先根据需要检测的转录因子(TF，transcription factor)，选择与之对应的promotor/TRE(transcription response element)，并将这个promotor/TRE的启动序列克隆到载体上（位置与报告基因相邻），然后将载体质粒转入细胞，如果细胞内TF具有活性，TF与promotor/TRE结合，荧光素酶报告基因得到表达，荧光强度发生变化；反之，如果细胞内相应的TF没有活性，荧光素酶报告基因在细胞内不表达。我们利用灵敏的Bethord 公司的Lumat LB9507荧光检测仪来检测细胞内报告基因的荧光强度，从而对转录因子进行活性分析。

②海肾荧光素酶报告基因载体phRL-SV40 Vector 具有海肾荧光素酶报告基因，该报告基因含SV40的启动子及增强子，能高水平表达海肾荧光素酶基因。可作为检测转染频率的内对照，使实验值可以规一化。

2.荧光素酶检测系统

荧光素酶检测系统 Dual-Luciferase®Reporter 1,000 Assay System 借助这一系统，可以对实验进行精确的分析。

荧光素酶检测仪器 Lumat LB9507荧光检测仪 提供在一般实验中好的灵敏度及应用性。软件内建DLReady双报导基因检测程序，最适合于报导基因检测的仪器。
◆超灵敏侦测仪，检测极限可达10-18mole ATP
◆双管式侦测室设计，提高一倍的实验效率
◆专利喷射式分注器，准确加样的同时达到混合样品的作用

■双荧光素酶报告基因系统的实验步骤

1.构建含promotor/TRE序列的萤火虫荧光素酶报告基因载体；

2.检测阳性菌落，测序；

3.提取纯化不含内毒素的重组萤火虫荧光素酶报告基因载体；

4.用构建好的质粒转染宿主细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统，利用灵敏的Bethord 公司的Lumat LB9507荧光检测仪来检测细胞内报告基因的荧光强度，从而对转录因子进行活性分析；在我们的检测系统中，两种荧光素酶可在单个样品中连续测量，连续两次的检测可在4秒钟时间内完成，我们检测的线性范围均在10-18摩尔的灵敏度范围以内