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Bst DNA 聚合酶, 大片段

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    ♦  富含 GC 区域的 DNA 测序（2，3）
    ♦  纳克含量 DNA 模板的快速测序（4）
    ♦   可用于要求嗜温链置换的实验


    概述
    Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有5´→3´DNA聚合酶活性，但不具有5´→3´外切核酸酶活性。


    来源
    来源于 E.coli 菌株，此菌株含有来自 Bacillusstearothermophilus DNA 聚合酶的基因，该基因缺失了5' →3' 外切核酸酶结构域。应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白（MBP）基因与该基因融合表达，融合蛋白经纯化后再在体外切除掉 MBP，纯化后的聚合酶不含 MBP（1）。


    反应缓冲液
    1X ThermoPol Reaction Buffer
    [20 mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25°C), 10 mM KCl, 10 mM (NH4 )2 SO4 , 2 mM MgSO4 , 0.1% Triton X-100]。


    单位定义
    1 单位指 65 ℃ 条件下，30 分钟内使 10 nmol 的 dNTP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。


    活性检测条件
    50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8),10 mM MgCl2 , 30 nM M13mp18 ssDNA, 70 nM M13测序引物 (-47) 24 mer, 200 μM dATP, 200 μM dCTP,200 μM dGTP, 100 μM [3 H] dTTP, 100 μg/ml BSA 和酶。65°C温育。


    浓度
    8,000 units/ml 和 120,000 units/ml。


    贮存条件
    50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100和50%甘油。贮存于-20°C。


    热失活
    80°C 10分钟。


    注意事项
    Bst DNA 聚合酶不具有 3' →5' 外切酶活性。
    长期贮存需加入 100 μg/ml BSA 或 0.1% Triton X-100。
    建议反应温度不要超过 70 ℃。
    Bst DNA 聚合酶不能用于热循环测序或 PCR。


    参考文献
    (1) Aliotta, J.M. et al. (1996) Genet . Anal., 12, 185–195.
    (2) Griffin, H. and Griffin, A. (1994). PCR Technology (p.p.228–229). Florida: CRC Press.
    (3) McClary, J. et al. (1991) J. DNA Sequencing and Mapping ,1, 173–180.
    (4) Mead, D.A. et al. (1991) BioTechniques, 11, 76–87.


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