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快速末端平齐化试剂盒

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    ■    将限制性内切酶消化后的 DNA 末端平齐化，仅需不到 30 分钟
    ■ 使用即用型预混液在室温即可进行反应
    ■ 适用于限制性内切酶消化后的 DNA，已剪切或雾化的 DNA 或 PCR 产物
    概述
    快速末端平齐化TM 试剂盒用于将 DNA 不匹配的 5' 或 3' 突出末端转变为带有 5' 磷酸的平齐末端，以便有效地与平齐末端 DNA 克隆载体连接。酶混合液中的 T4 DNA 聚合酶（NEB #M0203）能使 DNA末端平齐化，该酶同时具有 3' →5' 外切酶活性和 5'→3' 聚合酶活性。酶混合液中的另一成份是 T4 多聚核苷酸激酶（NEB #M0201），可将平齐末端 DNA 的5' 端磷酸化，以用于与克隆载体的连接反应。本试剂盒经过优化，可在单次反应中将 5 μg 的 DNA 末端平齐化。
    应用
    • 已剪切 DNA、雾化 DNA 以及经限制性内切酶消化的 DNA 进行末端平滑化，便于与质粒、粘粒、fosmid和 BAC 载体连接。
    • PCR 产物在进行平末端克隆前进行末端平齐化。
    快速末端平齐化TM 试剂盒组份
    ■ 平齐化酶混合液
    ■ 10X Blunting Buffer
    ■ 1 mM dNTP Mix
    质保声明
    用 ApaI 和 BamHI 消化 pUC19，产生 5' 和3' 末端突出 DNA 片段。使用上述片段检测该试剂盒平齐化突出 DNA 末端的能力。将此 DNA 的末端平齐化、连接，并转化到 NEB 的 5-α感受态细胞（NEB #C2991），涂布于含 X-gal、IPTG 和氨苄的平板上。蓝色克隆显示质粒 DNA 的 5' 突出末端以被补平，3' 突出末端已被移除。
    热失活
    70 ℃ 10 分钟。
    注意事项
    PCR 产物在进行末端平齐滑化之前必须纯化，可采用商业纯化试剂盒、酚抽提/乙醇沉淀法或者凝胶电泳的方法纯化 DNA。经限制性内切酶消
    化的 DNA 可无需纯化直接进行末端平齐化反应。末端平滑化酶混合液在 Blunting Buffer 中有最适活性，但在添加了 dNTPs 和 DTT 后的 NEBuffers 1、2、3、4 以及 EcoRI 和 DpnII 的特殊缓冲液中也具有活性。但在这些缓冲液中，连接的保真度有轻微下降。在NEBuffer 1 中，转化效率最低，为最佳效率的 50%。
     

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