高通量筛选发现STING降解剂
从天然产物库中鉴定能降低STING蛋白水平的化合物。
使用稳定表达EGFP-STING-IRES-mCherry的THP-1细胞系，通过流式检测EGFP荧光筛选约3700种天然产物及其衍生物，以AK59为阳性对照，并在2 μM、12 h条件下筛选。
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Omaveloxolone作为STING的分子撬棍样降解剂减轻衰老相关炎症
Omaveloxolone functions as a molecular crowbar-like degrader of STING to alleviate aging-related inflammation.
实验完整度
高包含THP-1等细胞系、Trex1-/-和自然衰老小鼠模型，并有降解、结合、泛素化及体内功能验证
主要模型
THP-1细胞系及THP-1衍生的巨噬细胞 RAW 264.7和L929细胞系 Trex1-/- C57BL/6小鼠 自然衰老雄性C57BL/6小鼠
重点核对
Omaveloxolone在THP-1细胞中的DC50 = 118 nM，Dmax = 98.6%（24 h，western blot，n=3） Omaveloxolone与hSTING LBD的KD = 21.4 nM，结合化学计量比2:1（ITC） Omaveloxolone诱导STING K27连接泛素化，关键赖氨酸为K236、K347、K370 HUWE1敲除或抑制剂BI8622阻断Omaveloxolone诱导的STING降解 自然衰老小鼠（22月龄雄性）腹腔注射Omaveloxolone 10 mg/kg，隔日一次，1个月后停药1个月再治疗1个月，n=5/组
摘要
STING信号通路的异常激活与衰老相关炎症有关，但目前尚无STING靶向疗法获得临床批准。在此，我们通过高通量筛选鉴定出Omaveloxolone——一种FDA批准用于Friedreich共济失调的药物——是一种有效的STING降解剂（DC50 = 118 nM，Dmax = 98.6%）。Omaveloxolone以高亲和力（KD = 21.4 nM）非共价结合于STING配体结合结构域（LBD）底部，并表现出与STING构象失稳一致的撬棍样行为：它阻碍LBD闭合、增加疏水性暴露并降低热稳定性。这种构象扰动被认为增强了E3泛素连接酶HUWE1的识别，导致STING赖氨酸K236/K347/K370处的K27连接泛素化和蛋白酶体降解。在体内，Omaveloxolone耗竭STING、抑制下游炎症信号并改善老年雄性小鼠的衰老相关炎症表型。由于Omaveloxolone也是一种已知的NRF2激活剂，这些体内益处可能反映了对炎症和抗氧化通路的双重调节。本研究提示Omaveloxolone是一种分子撬棍样STING降解剂，并为通过构象扰动靶向STING提供了机制框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Omaveloxolone是否通过靶向STING降解来减轻衰老相关炎症，以及其降解STING的分子机制是什么。
- 核心机制
- Omaveloxolone非共价结合于STING LBD底部（S162、T263、T267），诱导构象失稳和疏水暴露，增强HUWE1识别，导致STING K236/K347/K370的K27连接多泛素化和蛋白酶体降解。
- 主要证据
- 高通量流式筛选发现Omaveloxolone（DC50=118 nM，Dmax=98.6%）；FP、PTS、ITC、MD、HDX-MS验证结合与构象失稳；IP-MS和敲除实验鉴定HUWE1；泛素突变分析确定K27连接和K236/K347/K370位点；Trex1-/-和自然衰老小鼠体内实验显示STING降解、炎症抑制和衰老表型改善。
- 研究意义
- 本研究将Omaveloxolone鉴定为分子撬棍样STING降解剂，扩展了分子撬棍降解剂的靶点范围，支持非共价结合可介导该机制，并为通过构象扰动靶向STING以及扩展Omaveloxolone在衰老相关炎症疾病中的临床适应症提供了临床前基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证候选化合物的降解活性与细胞毒性
确认RTA系列化合物对STING的降解效果并选择最优候选。
用western blot检测RTA 401、402、dh404、405、408及齐墩果酸对STING的降解，计算DC50和Dmax，并用CellTiter-Glo评估细胞毒性。
确定降解途径依赖蛋白酶体
判断Omaveloxolone诱导的STING降解是否通过泛素-蛋白酶体途径。
检测STING蛋白和mRNA随时间变化；在NRF2敲除THP-1细胞中检测STING降解；用蛋白酶体抑制剂（PR171、PS341、MG-132）和溶酶体抑制剂（CQ、BafA1）预处理后检测STING；在HEK293T细胞中共转Flag-STING和HA-Ub检测STING泛素化。
验证Omaveloxolone与STING的直接结合及结合位点
确认Omaveloxolone直接结合STING LBD并鉴定关键结合残基。
用FP竞争实验检测Omaveloxolone与5-FAM-diABZI竞争结合hSTING LBD；用PTS检测热稳定性变化；用ITC测定KD和化学计量比；用MD模拟分析结合模式；用点突变（S162A、T263A、T267A）和PTS验证关键残基；用质谱检测共价加合物。
解析分子撬棍样构象失稳机制
验证Omaveloxolone通过构象扰动而非单纯结合来促进降解。
用PTS检测Omaveloxolone对多种STING突变体和mSTING热稳定性的影响；用MD模拟分析LBD开放构象、SASA、疏水表面积、二级结构和回旋半径；用HDX-MS检测氘摄取变化；比较类似物结合与降解活性。
鉴定E3泛素连接酶HUWE1及泛素化位点
确定介导Omaveloxolone诱导STING降解的E3连接酶和泛素链类型。
用IP-MS筛选Omaveloxolone处理后富集的E3连接酶；用sgRNA敲除候选E3连接酶；用HUWE1抑制剂BI8622验证；用Co-IP和NanoBiT检测STING-HUWE1相互作用；用STING赖氨酸突变和泛素赖氨酸突变分析泛素化位点和连接类型；用UBA1抑制剂TAK-243和UbcH5b抑制剂IJ-5验证E1-E2-E3级联。
评估细胞水平STING通路抑制效果
验证Omaveloxolone降解STING并抑制下游信号和炎症基因表达。
用SEAP和荧光素酶报告基因检测cGAMP诱导的STING激活；用western blot检测STING、TBK1、IRF3、p65、STAT3磷酸化；用RT-qPCR检测IFNB1、CXCL10；用RNA-seq和GSEA分析转录组变化。
体内验证Trex1-/-小鼠中的STING降解和炎症抑制
评估Omaveloxolone在STING持续激活模型中的体内药效。
给4-7周龄Trex1-/- C57BL/6小鼠腹腔注射Omaveloxolone或溶剂21天，检测心脏STING、p-TBK1、p-IRF3蛋白及心、肾、肌肉炎症基因表达。
体内验证自然衰老小鼠中的抗炎和抗衰老效果
评估Omaveloxolone对衰老相关炎症和脑衰老表型的影响。
22月龄雄性C57BL/6小鼠腹腔注射Omaveloxolone（10 mg/kg，隔日）或H-151（10 mg/kg，每日），治疗1个月、停药1个月后再治疗1个月；检测肝、肾、脑炎症基因，抓力，海马IBA1、NeuN、Synaptophysin，以及脑STING/p-TBK1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选与验证STING降解活性
验证泛素化与降解机制
评估STING通路抑制与转录组变化
评估体内炎症与衰老表型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物处理 | Omaveloxolone | MedChemExpress (MCE) | HY-12212 |
| STING激活 | cGAMP | MedChemExpress (MCE) | HY-100564A |
| 阳性对照 | AK59 | MedChemExpress (MCE) | HY-162563 |
| STING抑制对照 | H-151 | MedChemExpress (MCE) | HY-112693 |
| STING激动剂对照 | SR-717 | MedChemExpress (MCE) | HY-131454 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | MedChemExpress (MCE) | HY-13259 |
| PS341 | MedChemExpress (MCE) | HY-10227 | |
| PR171 | MedChemExpress (MCE) | HY-10455 | |
| 溶酶体抑制 | 氯喹 | MedChemExpress (MCE) | HY-17589A |
| 巴弗洛霉素A1 | MedChemExpress (MCE) | HY-100558 | |
| HUWE1抑制 | BI8622 | MedChemExpress (MCE) | HY-120929 |
| UBA1抑制 | TAK-243 | MedChemExpress (MCE) | HY-100487 |
| UbcH5b抑制 | IJ-5 | MedChemExpress (MCE) | HY-124670 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Meilunbio | MA0215 |
| DMEM培养基 | Meilunbio | MA0212 | |
| MEM培养基 | BasalMedia | L540KJ | |
| 胎牛血清 | MeilunBio | PWL001 | |
| 青霉素-链霉素 | MeilunBio | MA0110 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 嘌呤霉素 | MeilunBio | MB2005-1 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂 | Bimake | B14001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Bimake | B15001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0015L | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗磷酸化TBK1 (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗磷酸化IRF3 (Ser396)抗体 | Cell Signaling Technology | 29047 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 11904 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640 | |
| 抗NRF2抗体 | Cell Signaling Technology | 12721 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 | |
| 抗Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 抗K27连接特异性泛素抗体 | Abcam | ab181537 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗HUWE1抗体 | Cell Signaling Technology | 5695 | |
| RT-qPCR | RNA-easy分离试剂 | Vazyme | R701-01 |
| HiScript III qRT SuperMix | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q331-03 | |
| 蛋白纯化 | Histrap HP层析柱 | Cytiva | -- |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | -- | |
| 荧光偏振实验 | 5-FAM标记的diABZI | -- | -- |
| 蛋白质热迁移实验 | SYPRO Orange染料 | Merck | S5692 |
| 免疫沉淀 | 抗Flag磁珠 | Selleck | B26102 |
| 蛋白A/G磁珠 | Selleck | B23201 | |
| NanoBiT互补实验 | Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | N1110 |
| 报告基因实验 | QUANTI-Blue试剂盒 | InvivoGen | rep-qbs2 |
| QUANTI-Luc试剂盒 | InvivoGen | rep-qlc2 | |
| 衰老染色 | SA-β-Gal染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 流式筛选 | 化合物浓度2 μM、处理12 h、THP-1EGFP-STING细胞、阳性对照AK59 阅读提示：Methods流式细胞术小节及Fig. 1b–g图注 |
| STING降解动力学与途径 | Omaveloxolone浓度（500 nM或1 μM）、处理时间（6–24 h）、蛋白酶体抑制剂预处理1 h、MG-132 5 μM 阅读提示：Methods Western blot和Co-IP小节及Fig. 2a–g图注 |
| 结合与热稳定性实验 | STING蛋白浓度（FP 400 nM，PTS 2 μM，ITC 100 μM）、化合物浓度（FP系列稀释，PTS 1 μM，ITC 10 μM）、5-FAM-diABZI 360 nM 阅读提示：Methods FP、PTS、ITC小节及Fig. 3图注 |
| HUWE1与泛素化验证 | OMA浓度（350 nM或500 nM）、处理时间（6或12 h）、BI8622 20 μM、PR171 2 μM、MG-132 5 μM、HUWE1敲除 阅读提示：Methods Co-IP和NanoBiT小节及Fig. 5图注 |
| Trex1-/-小鼠体内实验 | 小鼠周龄4–7周、OMA 10 mg/kg腹腔注射21天、n=5只/组、溶剂组成（5% DMSO、40% PEG300、5% Tween-80） 阅读提示：Methods动物实验和Trex1-/-小鼠模型小节及Fig. 6l–o图注 |
| 自然衰老小鼠体内实验 | 22月龄雄性C57BL/6小鼠、OMA 10 mg/kg隔日腹腔注射、H-151 10 mg/kg每日、治疗至25月龄、n=5只/组 阅读提示：Methods衰老小鼠模型小节及Fig. 7a–i图注 |