药物筛选
筛选能够上调骨肉瘤细胞MHC I表达的临床常用药物。
在K7M2和143B细胞中检测12种药物的细胞毒性并计算IC50，以IC50浓度处理24小时后，通过流式检测MHC I表达。
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依托泊苷通过肿瘤分泌的IL-33介导的信号上调MHC I，激活骨肉瘤中CD8+ T细胞抗肿瘤免疫
Etoposide activates CD8+ T cell anti-tumor immunity in osteosarcoma through MHC I upregulation via tumor-secreted IL-33 mediated signaling
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型（同系移植、复发、肺转移）、患者样本分析及RNA-seq和ChIP-seq等机制验证。
主要模型
K7M2小鼠骨肉瘤细胞 143B人骨肉瘤细胞 K7M2同系移植瘤BALB/c小鼠模型 骨肉瘤患者外周血单个核细胞
重点核对
药物筛选：评估12种临床常用药物在IC50剂量下处理24小时对MHC I表达的影响。 CD8+ T细胞毒性测定：K7M2与活化CD8+ T细胞共培养24小时，检测K7M2凋亡。 MHC I阻断：使用InVivoMAb抗小鼠MHC I类（H-2）抗体在依托泊苷处理前2小时加入。 IL-33中和：使用抗IL-33抗体（200 ng/mL）在依托泊苷处理前2小时加入。 动物模型：K7M2同系移植模型，依托泊苷8 mg/kg腹腔注射每2天一次。
摘要
背景
转移和复发倾向高的骨肉瘤患者通常预后不良。尽管免疫治疗（尤其是抗程序性细胞死亡蛋白1（anti-PD-1）抗体）在临床试验中得到了广泛探索，但疗效仍不令人满意。更深入地理解耐药机制并开发创新的治疗策略势在必行。
方法
在临床常用药物中筛选能够上调主要组织相容性复合体I类（MHC I）表达的药物。在体外和体内骨肉瘤模型中研究了该药物对T细胞和肿瘤细胞的影响，及其与抗PD-1抗体的联合疗效。通过RNA测序分析探讨了这些生物学过程的分子机制。
结果
依托泊苷被证明能上调骨肉瘤细胞中MHC I的表达，从而增强CD8+ T细胞的细胞毒性。白细胞介素-33（IL-33）在依托泊苷激活的抗肿瘤免疫应答中起主导作用。依托泊苷促进IL-33的分泌，并增加IL-33结合受体ST2的表达，从而激活核因子kappa-B信号通路，导致MHC I上调。此外，依托泊苷被证明能提高抗PD-1抗体的治疗效果。
结论
本研究揭示了依托泊苷激活CD8+ T细胞抗肿瘤免疫的分子机制。依托泊苷与抗PD-1抗体的联合治疗有可能使晚期骨肉瘤患者获益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过上调MHC I表达增强骨肉瘤中CD8+ T细胞抗肿瘤免疫，并提高免疫检查点抑制剂的疗效？
- 核心机制
- 依托泊苷促进肿瘤细胞分泌IL-33并上调其受体ST2，激活NF-κB信号通路，导致MHC I表达上调，进而增强CD8+ T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力；同时IL-33直接激活CD8+ T细胞。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示依托泊苷上调MHC I表达并增强CD8+ T细胞杀伤；RNA-seq发现IL-33上调；Western blot显示NF-κB p65磷酸化；ChIP-seq证实p65结合于H2-K1和H2-D1启动子；体内模型证实联合抗PD-1疗效。
- 研究意义
- 本研究为依托泊苷联合抗PD-1治疗骨肉瘤提供了科学依据，提示该联合方案可能使晚期骨肉瘤患者获益。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外CD8+ T细胞毒性实验
验证依托泊苷预处理的肿瘤细胞是否通过MHC I上调增强CD8+ T细胞的杀伤能力。
将依托泊苷预处理的K7M2细胞（部分加入MHC I阻断抗体）与活化的CD8+ T细胞共培养，检测肿瘤细胞凋亡率。
体内疗效评估（同系移植模型）
评估依托泊苷单独或联合抗PD-1抗体对骨肉瘤生长、免疫微环境和转移的影响。
在BALB/c小鼠胫骨内接种K7M2细胞建立同系移植模型，给予依托泊苷、抗PD-1抗体、CD8+ T细胞清除或IL-33中和等处理，监测肿瘤生长，并通过流式分析肿瘤浸润免疫细胞。
RNA-seq及机制验证
揭示依托泊苷诱导MHC I上调的分子机制。
从K7M2荷瘤小鼠中分选T细胞和非免疫细胞进行RNA-seq，鉴定差异表达细胞因子；随后通过Western blot、ChIP-seq和siRNA敲降实验验证IL-33-ST2-NF-κB通路的作用。
联合治疗与临床样本验证
验证依托泊苷与抗PD-1联合治疗的长期疗效及临床转化潜力。
建立术后复发模型和肺转移模型，评估联合治疗对肿瘤复发和转移的影响；并分析一名接受依托泊苷联合替雷利珠单抗治疗的骨肉瘤患者的PBMC中CD8+ T细胞功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | WISENT | 085-450 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度培养基 | Cytiva | 17144002 |
| 药物处理 | 依托泊苷 | Selleck | S1225 |
| 吉西他滨 | Selleck | S1714 | |
| 甲氨蝶呤 | Selleck | S1210 | |
| 拓扑替康 | Selleck | S9321 | |
| 帕唑帕尼 | Selleck | S3012 | |
| 瑞戈非尼 | Selleck | S1178 | |
| 索拉非尼 | Selleck | S7397 | |
| 雷帕霉素 | Selleck | S1039 | |
| 依维莫司 | Selleck | S1120 | |
| 卡博替尼 | Selleck | S1119 | |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | NCM | C6005 |
| SpectraMax M3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| CD8+ T细胞分离 | EasySep小鼠初始CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19858 |
| CD8+ T细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| CD8+ T细胞活化 | Ultra-LEAF纯化抗小鼠CD3ε抗体 | BioLegend | 100340 |
| Ultra-LEAF纯化抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 102116 | |
| 小鼠IL-2重组蛋白 | PeproTech | 212-12 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒 | YEASEN | 40 |
| 流式分析 | 无酶细胞解离缓冲液 | Gibco | 13151014 |
| 纯化抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| PE抗小鼠H-2Kd抗体 | BioLegend | 116607 | |
| PE小鼠IgG2a, κ同型对照抗体 | BioLegend | 400211 | |
| PE抗小鼠IL-33Rα抗体 | BioLegend | 145303 | |
| PE大鼠IgG2a, κ同型对照抗体 | BioLegend | 400507 | |
| 人Fc受体阻断溶液 | BioLegend | 422301 | |
| PE抗人HLA-A,B,C抗体 | BioLegend | 311405 | |
| PE小鼠IgG2a, κ同型对照抗体 | BioLegend | 400213 | |
| C6 Plus流式细胞仪 | BD | -- | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| 肿瘤浸润细胞分离 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Invitrogen | 18047019 | |
| 70 µm细胞筛网 | Beyotime | FSTR072 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 | |
| 流式分析 | FITC抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103107 |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100217 | |
| APC抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100411 | |
| PE抗小鼠CD8b抗体 | BioLegend | 126607 | |
| 细胞活化混合物（含布雷菲德菌素A） | BioLegend | 423303 | |
| APC抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100235 | |
| 细胞内固定和透化缓冲液 | eBioscience | 88-8823-88 | |
| Pacific Blue抗小鼠穿孔素抗体 | BioLegend | 154311 | |
| Alexa Fluor 700抗小鼠IFN-γ抗体 | BioLegend | 505823 | |
| PerCP抗人/小鼠颗粒酶B重组抗体 | BioLegend | 396415 | |
| Brilliant Violet 605抗小鼠TNF-α抗体 | BioLegend | 506329 | |
| 流式分析（人样本） | FITC抗人CD3抗体 | BioLegend | 317305 |
| APC抗人CD4抗体 | BioLegend | 300514 | |
| PE抗人CD8抗体 | BioLegend | 344705 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Beyotime | R0016 |
| RNA-seq | Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Qubit 3.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| Nanodrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| RT-PCR | HiScript III一步法RT SuperMix（qPCR用） | Vazyme | R333-01 |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-03 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1050 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0015 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme | PG112 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| IL-33多克隆抗体 | Proteintech | 12372-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| NF-κB p65兔单克隆抗体 | CST | 8242 | |
| 磷酸化NF-κB p65兔单克隆抗体 | CST | 3033 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| siRNA转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000075 | |
| 体内实验（PBS） | 磷酸盐缓冲液 | Biotend | RE100001 |
| 体内实验（CD8清除） | 抗小鼠CD8α抗体（体内用） | Selleck | A2102 |
| 体内实验（同型对照） | 大鼠IgG2b同型对照（体内用） | Selleck | A2116 |
| 体内实验（抗PD-1） | InVivoMab抗小鼠PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 |
| 体内实验（抗IL-33） | 小鼠IL-33抗体 | R&D | AF3626 |
| 体内实验（IL-33处理） | 小鼠IL-33重组蛋白 | PeproTech | 210-33 |
| 机制验证（NF-κB抑制） | BAY 11-7082 | MCE | HY-13453 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物筛选 | 药物种类、浓度（IC50）、处理时间（24小时）、检测方法（FACS） 阅读提示：Methods: Cell viability assay and drugs screening, Figure 1D-G |
| CD8+ T细胞毒性测定 | T细胞分离和活化条件（anti-CD3/anti-CD28、IL-2浓度、活化时间）、效应细胞与靶细胞比例（1:1）、共培养时间（24小时）、MHC I阻断抗体的浓度和时间 阅读提示：Methods: CD8+ T cell cytotoxicity assay, Figure 2C-D |
| 体内同系移植模型 | 小鼠品系（BALB/c）、细胞系（K7M2）、接种数量和途径、给药方案（依托泊苷8 mg/kg i.p.每2天；抗PD-1 10 mg/kg i.p.每3天；CD8清除100 μg/只每4天；抗IL-33 2 μg/只静脉注射每3天） 阅读提示：Methods: Mice and in vivo treatments, Figure 1H-I, 2E, 3H |
| 机制验证（IL-33/ST2/NF-κB） | IL-33中和抗体浓度（200 ng/mL）、NF-κB抑制剂浓度（10 μM）、ST2 siRNA敲降效率、ChIP-seq所用p65抗体 阅读提示：Methods: FACS analysis, Transient degradation small interfering RNA delivery, Chromatin immunoprecipitation sequencing analysis, Figure 4 |
| 联合治疗与临床样本 | 复发模型和肺转移模型的建立方法、临床患者治疗方案（依托泊苷500 mg/m2, 替雷利珠单抗200 mg Q28D）、PBMC分离和CD8+ T细胞功能检测的流式抗体、样本量（n=3） 阅读提示：Methods: Study cohort and human samples, FACS analysis, Figure 5, 6 |