SCT-1015的设计与合成
基于尼洛替尼设计并合成新型AMPK激活剂，以增强AMPK激活特异性并避免对abl激酶的抑制。
以尼洛替尼为先导化合物，通过结构修饰合成SCT-1015，包括替换吡啶环为吡咯、去除咪唑环、以脲连接，并进行了核磁共振和质谱表征。
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一种新型AMPK激活剂通过抑制HIF1α介导的有氧糖酵解在肝细胞癌中显示出治疗潜力
A novel AMPK activator shows therapeutic potential in hepatocellular carcinoma by suppressing HIF1α-mediated aerobic glycolysis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（细胞活力、克隆形成、ECAR、代谢物测定、蛋白印迹）、体内动物模型（PLC5和Huh7异种移植瘤）、临床样本IHC分析以及分子机制验证（免疫共沉淀、分子对接、激酶实验）。
主要模型
PLC5细胞系 Huh7细胞系 PLC5异种移植瘤小鼠模型 Huh7异种移植瘤小鼠模型
重点核对
SCT-1015处理剂量和时间（体外20 μM处理24小时；体内25 mg/kg口服） AMPKα1敲低和过表达的影响（shAMPKα1和csAMPK） HIF1α和PDK1过表达对SCT-1015效应的逆转 细胞活力检测（PrestoBlue试剂）和ECAR测量（海马分析仪） 体内实验使用5周龄雄性BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl裸鼠
摘要
肝细胞癌（HCC）以快速生长、早期血管侵犯和高转移为特征。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物疗效低，限制了HCC的治疗选择，使其局限于化疗。我们设计并合成了一种新型小分子SCT-1015，它能变构激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK），从而抑制HCC中的有氧糖酵解。SCT-1015被证明能与AMPK α和β亚基界面结合，从而暴露激酶α结构域给上游激酶，导致AMPK活性增加。SCT-1015在体外显著减少HCC细胞生长，在体内显著减少肿瘤生长。我们进一步发现AMPK与缺氧诱导因子1-α（HIF1α）形成蛋白复合物，且SCT-1015激活的AMPK促进HIF1α的羟基化（402P和564P），导致HIF1α通过泛素-蛋白酶体系统降解。随着HIF1α丰度下降，许多糖酵解相关酶下调，抑制有氧糖酵解，并促进氧化磷酸化。这些结果表明SCT-1015将HCC细胞引导至不利的代谢状态。总之，我们报道了SCT-1015作为AMPK信号的直接激活剂，在HCC中具有治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SCT-1015能否通过激活AMPK调控HIF1α介导的有氧糖酵解，从而抑制肝细胞癌的生长？
- 核心机制
- SCT-1015变构激活AMPK，通过ERK/PHD依赖性HIF1α羟基化促进其泛素-蛋白酶体降解，并通过抑制mTORC1信号减少HIF1α蛋白合成，从而下调HIF1α丰度，抑制有氧糖酵解并促进氧化磷酸化。
- 主要证据
- 体外实验中SCT-1015降低细胞活力、克隆形成能力，减少ECAR和糖酵解代谢物，增加PDH活性；体内实验中降低PLC5和Huh7异种移植瘤生长，且AMPKα1敲低可消除其抗肿瘤作用。
- 研究意义
- 该研究证明AMPK激活剂SCT-1015在HCC治疗中具有潜在应用价值，为代谢重编程治疗策略提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SCT-1015对AMPK的直接激活验证
验证SCT-1015是否直接结合并激活AMPK。
通过体外激酶实验（使用内源性AMPKα1免疫沉淀物和重组AMPKα1/β1/γ1复合物）、分子对接和2D相互作用图分析SCT-1015与AMPK的结合模式，并检测对Abl1激酶活性的影响。
SCT-1015抑制HCC细胞增殖和糖酵解
评估SCT-1015对HCC细胞活力、克隆形成和代谢表型的影响。
在PLC5、Huh7和SK-HEP-1细胞中检测细胞活力（PrestoBlue）和克隆形成能力；在PLC5和Huh7细胞中测定ECAR；在PLC5细胞中进行代谢物组学分析；检测糖酵解相关蛋白（HK2、PFKP、PGAM1、LDHA、PDH）表达和PDH活性。
AMPK与HIF1α的负相关和调控机制
探讨AMPK是否调控HIF1α蛋白稳定性及其负相关关系。
在7种HCC细胞系中检测p-AMPKα和HIF1α表达并分析相关性；在26例HCC患者组织中进行IHC染色；在PLC5细胞中过表达AMPKα1/α2或敲低AMPKα1，检测HIF1α蛋白水平、羟基化、泛素化降解、转录水平及免疫共沉淀。
SCT-1015调控AMPK/HIF1α/PDK1轴
验证SCT-1015通过AMPK/HIF1α/PDK1通路影响细胞活力和PDH活性。
在PLC5细胞中，通过shAMPKα1敲低、HIF1α或PDK1过表达，检测SCT-1015处理后的蛋白表达、细胞活力和PDH活性。
SCT-1015对ERK和mTORC1信号的调控
阐明SCT-1015减少HIF1α的分子机制是否涉及ERK和mTORC1通路。
在PLC5、Huh7和SK-HEP-1细胞中检测SCT-1015处理后ERK磷酸化、4E-BP1和S6K磷酸化、PHD3与HIF1α相互作用、羟化酶抑制剂roxadustat的影响以及自噬通量。
SCT-1015的体内抗肿瘤效果
评估SCT-1015在异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果及其对AMPK的依赖性。
使用PLC5或Huh7细胞皮下注射建立裸鼠异种移植瘤模型，口服给予SCT-1015或对照，测量肿瘤体积和体重，并进行western blot和IHC分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物合成 | Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2 | -- | -- |
| 细胞培养 | PrestoBlue细胞活力试剂 | Thermo Fisher Scientific | A13262 |
| Cell-Tak | Corning | -- | |
| 基质胶 | Corning | 354248 | |
| 凋亡检测 | ToxiLight生物测定试剂盒 | Lonza | LT07-217 |
| 代谢检测 | Seahorse XFe24细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 代谢物测定 | 毛细管电泳-飞行时间质谱 | -- | -- |
| 毛细管电泳-三重四极杆质谱 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | Pierce IP裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 87788 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78442 | |
| 蛋白A/G混合磁珠 | Millipore | LSKMAGAG02 | |
| 增强化学发光系统 | Bioshop Canada | GTX14698 | |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| qPCR | 罗氏LightCycler 480序列检测系统 | Roche Applied Science | -- |
| 激酶实验 | CycLex AMPK激酶测定试剂盒 | MBL International | CY-1182 |
| 重组AMPKα1/β1/γ1复合物 | Enzo Life Science | BML-SE491 | |
| 重组AMPKα1/β1/γ1复合物 | Elabscience | PKSH030314 | |
| CaMKKβ重组蛋白 | Thermo Fisher Scientific | PV4206 | |
| 激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | #9802 | |
| ATP | Cell Signaling Technology | #9804 | |
| PDH活性 | PDH活性测定试剂盒 | BioVision | K679-100 |
| PP2A活性 | PP2A免疫沉淀磷酸酶测定试剂盒 | Merck | 17-313 |
| 抗体 | 抗p-AMPKα抗体 (#2535) | Cell Signaling Technology | #2535 |
| 抗AMPKα抗体 (#5831) | Cell Signaling Technology | #5831 | |
| 抗PDK1抗体 (#3820) | Cell Signaling Technology | #3820 | |
| 抗HIF1α抗体 (#3716) | Cell Signaling Technology | #3716 | |
| 抗己糖激酶2抗体 (#2867) | Cell Signaling Technology | #2867 | |
| 抗LDHA抗体 (#3582) | Cell Signaling Technology | #3582 | |
| 抗PFKP抗体 (#8164) | Cell Signaling Technology | #8164 | |
| 抗PGAM1抗体 (#12098) | Cell Signaling Technology | #12098 | |
| 抗PDH抗体 (#3205) | Cell Signaling Technology | #3205 | |
| 抗磷酸化苏氨酸/酪氨酸抗体 (#9381) | Cell Signaling Technology | #9381 | |
| 抗p-S6K抗体 (#9234) | Cell Signaling Technology | #9234 | |
| 抗S6K抗体 (#2708) | Cell Signaling Technology | #2708 | |
| 抗p-ERK抗体 (#4370) | Cell Signaling Technology | #4370 | |
| 抗ERK抗体 (#4695) | Cell Signaling Technology | #4695 | |
| 抗p-4E-BP1抗体 (Thr37/46, #2855) | Cell Signaling Technology | #2855 | |
| 抗p-4E-BP1抗体 (Ser65, #9451) | Cell Signaling Technology | #9451 | |
| 抗4E-BP1抗体 (#9644) | Cell Signaling Technology | #9644 | |
| 小鼠抗兔IgG单克隆抗体 (#5127) | Cell Signaling Technology | #5127 | |
| 抗兔IgG抗体 (#7074) | Cell Signaling Technology | #7074 | |
| 抗HIF1α羟基化P564抗体 (ab72777) | Abcam | ab72777 | |
| 抗PHD3抗体 (ab30782) | Abcam | ab30782 | |
| 抗HIF1α羟基化P402抗体 (07-1585) | Merck | 07-1585 | |
| 抗GAPDH抗体 (sc-25778) | Santa Cruz Biotechnology | sc-25778 | |
| 抗肌动蛋白抗体 (GTX109639) | GeneTex International | GTX109639 | |
| 抗HIF1α抗体 (#36169) | Cell Signaling Technology | #36169 | |
| 兔单克隆IgG抗体 (#3900) | Cell Signaling Technology | #3900 | |
| 抗AMPKα1抗体 (sc-398861) | Santa Cruz Biotechnology | sc-398861 | |
| 抗p-AMPKα抗体 (GTX52341) | GeneTex International | GTX52341 | |
| 抗HIF1α抗体 (GTX127309) | GeneTex International | GTX127309 | |
| 动物实验 | 丙二醇 | -- | -- |
| Kolliphor HS 15 | -- | -- | |
| 雷帕霉素 | -- | -- | |
| SCT-1015 | -- | -- | |
| 免疫组化 | VentanaBenchMark XT自动染色机 | Ventana | -- |
| EnVision系统 | DakoCytomation | -- | |
| DAB底物显色液 | DakoCytomation | -- | |
| LSAB2链霉亲和素-生物素复合物系统 | Dako | -- | |
| 自噬检测 | CYTO-ID自噬检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | ENZ-51031 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞系、细胞密度、SCT-1015浓度和处理时间（48或72小时） 阅读提示：Materials and methods 2.8节及Fig. 3A图注 |
| ECAR测量 | 细胞密度、处理时间（24小时）、注射的葡萄糖/寡霉素/2-DG浓度 阅读提示：Materials and methods 2.16节及Fig. 3C图注 |
| 蛋白表达分析 | 抗体目录号、蛋白裂解液、免疫沉淀条件 阅读提示：Materials and methods 2.4、2.14节 |
| 体内异种移植瘤模型 | 细胞系、接种数量、小鼠品系和性别、给药剂量和频率 阅读提示：Materials and methods 2.17节及Fig. 7图注 |
| HIF1α降解机制验证 | CHX和MG132浓度、处理时间、羟基化抗体 阅读提示：Materials and methods 2.4节及Fig. 4D,E图注 |